Yakın kızılötesi floresan ve yüksek çözünürlüklü tarama kullanarak kemirgen beynindeki protein ekspresyonunun ölçülmesi

Amigdala nöronlarında AMPA ve NMDA reseptörleri için immün olarak boyanmış sıçan beyin dokusu bölümlerini içeren bir cam slayt alın.

AMPA reseptörleri, glutamat kaynaklı sodyum akışına ve hızlı uyarıcı sinaptik iletime aracılık eder.

Buna karşılık, NMDA reseptörleri glutamat ve ko-agonist kaynaklı sodyum ve kalsiyum akışına aracılık ederek yavaş uyarıcı sinaptik iletimi kolaylaştırır.

Reseptörler primer antikorlarla boyanır ve yakın kızılötesi florofor etiketli sekonder antikorlar kullanılarak tespit edilir.

Slaytı doku yüzü aşağı bakacak şekilde yakın kızılötesi tarama arayüzüne yerleştirin.

Görüntüleme parametrelerini ayarlayın ve görüntülemeye başlayın.

Lazer aydınlatması üzerine, AMPA ve NMDA reseptörleri üzerindeki floroforlar floresan yayar.

Yakın kızılötesi görüntüleme, otofloresanı en aza indirerek sinyal netliğini artırır.

Yüksek çözünürlüklü tarama, floresan sinyallerinin net bir şekilde ayırt edilmesini sağlayarak amigdaladaki yakındaki AMPA ve NMDA reseptörlerinin hassas bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.

Görüntüleme yazılımını kullanarak, öğrenme ve hafızanın bir belirteci olarak belirli bir ilgi alanındaki AMPA/NMDA floresan yoğunluk oranını hesaplayın.

Slaytları, doku aşağı bakacak şekilde yakın kızılötesi tarama arayüzüne yerleştirin. Bir seçim aracı kullanarak aynı anda birden fazla slayt görüntüleyin. 21 mikrometre çözünürlüğe sahip en yüksek kalite ayarını kullanarak slaytları görüntüleyin. 0 nanometrelik bir ofsette, yarı kantitatif protein analizi için görüntülemek ve işaretlemek üzere görüntüleri Görüntü Analizi yazılımına aktarın.

Görüntü Analizi yazılımını açtıktan sonra, görüntünün tarandığı çalışma alanını seçin. Ardından, taramayı görüntülemek için taranan görüntüyü Görüntü Analizi yazılımında açın ve ham görüntüyü veya toplam niceliksel emisyonu değiştirmeden gösterilen dalga boylarını, kontrastı, parlaklığı ve büyütmeyi ayarlayın.

Niceleme için anahtar bölgeleri belirledikten sonra, sayfanın üst kısmındaki Analiz sekmesini seçin, ardından ölçülecek alanın üzerine bir dikdörtgen çizmek için Dikdörtgen Çiz'i seçin. Dikdörtgen boyutunu görüntülemek için ekranın sol alt kısmındaki Şekiller'i seçin. Ardından, sağ alttaki Sütunlar'ı seçin. Ardından, şekil boyutunu belirlemek için Yükseklik ve Genişlik sütunlarını ekleyin. Son olarak, şekle bir ad verin ve tekrarlayın. Tüm bölgeler örneklendikten sonra, Sütunlar sekmesinde bulunan verileri birleştirmeye ve analiz etmeye devam edin.