JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 5:37 dk. • May 29th, 2025
İntraepidermal sinir lifleri veya IENF'ler, ince duyusal nöron uçları içeren bir epidermal cilt dokusu bölümü ile başlayın.
IENF'ler mitokondri açısından zengindir ve nöron sinyal iletimi için enerji sağlar.
Doku, floresan olarak işaretlenmiş IENF'lere, mitokondriye ve epidermal çekirdeklere sahiptir.
Ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop kullanarak, çekirdekler, IENF'ler ve mitokondri için uygun dalga boylarında sıralı olarak ayrı floresan sinyalleri elde edin.
Epidermal katmanı kapsayan IENF sinyalini yakalamak için canlı bir taramayı etkinleştirin.
Ardından, floresan sinyal karışmasını ortadan kaldırmak için her sinyal için sıralı tarama yapın.
Birleştirilmiş görüntüden, yazılımı kullanarak, mavi floresan epidermal hücreleri kırpın ve izole edin.
Ardından, yeşil IENF sinyallerinin ve kırmızı mitokondriyal sinyallerin çözünürlüğünü artırmak için kırpılan alanı işleyin.
Ardından, IENF'ler için bir maske oluşturmak üzere bir 3B yüzey görüntüsü oluşturun, ardından sinire özgü mitokondriyi izole etmek için mitokondriyal yüzey görüntüsünün üzerine yerleştirin.
Son çıktıda, IENF'ler camgöbeği içinde görünürken, mitokondri küçük macenta renkli yapılar olarak görünür.
Ters çevrilmiş lazer taramalı konfokal mikroskopta 40x yağa daldırma objektifini seçin. Çekirdekleri, sinir liflerini ve mitokondriyi görüntülemek için uygun lazerleri ve dedektörleri seçin. Aşağıdaki tarama parametrelerini mikroskop yazılımı 12 bit yoğunluk çözünürlüğüne girin. İki kare ortalaması ile 600 Hz tarama hızı ve 2,2 yakınlaştırma. 1024 x 1024 tarama çözünürlüğü seçerek mikroskop yazılımını optimize edilmiş yanal çözünürlük için ayarlayın. 210 nanometre z adım boyutuna sahip bir havadar birimin konfokal diyaframını seçerek eksenel çözünürlüğü ve optik kesitlemeyi optimize edin.
Her sinyali ayrı ayrı tarayın ve aşırı ve az doymuş pikselleri çıkarmak için dedektör voltajını ve ofsetini ayarlayın. Sinir sinyali için canlı bir taramayı etkinleştirin ve doku kesiti içindeki sinir sinyalini kapsayan mikroskop yazılımında üst ve alt odak düzlemlerini bulmak ve ayarlamak için z odak kontrolünü ayarlayın. Floresan sinyal karışmasını ortadan kaldırmak için son z serisini sıralı tarama ile tarayın.
Epidermisin etrafına bir bölge çizerek, orijinal görüntünün yinelenen bir görüntüsü üzerinde bir seçim aracı kullanarak epidermisi stratum corneum ve dermisten izole edin. Ardından görüntüyü seçime göre kırpın. Yayılma işlevini hesapla özelliğini kullanarak yeşil ve kırmızı floresan konfokal sinyaller için nokta yayılma işlevlerini hesaplayın. Ardından, yağ için orta kırılma indisi parametrelerini 1.515'e ve 40x yağ objektifi için sayısal açıklığı 1.25'e ayarlayın. Dedektör iğne deliğini bir alana, birime ayarlayın ve bir lazer uyarma dalga boyu seçin.
%100 güvenirliğe, 10 döngülük yineleme sınırına ayarlanmış yinelemeli geri yüklemeyi ve yeşil ve kırmızı floresan sinyallerinin evrişimini gidermek için yeşil ve kırmızı PSF'leri kullanın. Dekonvolvasyonlu sinir sinyallerinin etrafında bir yüzey oluşturmak için Yüzey Oluştur aracını kullanın, denetlenmemiş pürüzsüz özellik, eşikleme için mutlak yoğunluk, 3.000 alt eşik ve 65.535 üst eşik seçin. Yüzeyleri 10 vokselin üzerinde tutun.
Sinir olmayan tek yüzeyleri seçmek için sinir yüzeyindeki Düzenle sekmesini kullanarak sinir olmayan yüzeyleri çıkarın veya birden fazla sinir olmayan yüzeyi seçmek için Kontrol tuşunu basılı tutun. Sil düğmesine basarak seçilen sinir dışı yüzeyleri silin. Sinir yüzeyindeki Düzenle sekmesini kullanın ve Maske özelliklerinde Tümünü Maskele düğmesine basın.
Yeni pencerede, Kanal seçimi altında Kanal 5 Mitokondri Deconvolved'i seçin ve ardından maskeyi uygulamadan önce yinelenen kanalı kontrol edin. Sabit iç dış için radyo düğmesine basın ve ayarlanmış voksellerin dış yüzeyini 0.0 olarak kontrol edin. Ve OK düğmesine basın.
Son olarak, işaretlenmemiş Düzgün özelliğini seçerek ve eşikleme için Arka Plan Çıkarma'yı kullanarak maskelenmiş dekonvolvasyonlu mitokondriyal sinyallerin etrafında bir yüzey oluşturmak için Yüzey Oluştur aracını kullanarak mitokondriye özgü yüzeyler oluşturun. En büyük kürenin çapını 1.50 mikrometreye, alt eşiği 2.000'e ve üst eşiği maksimum 65.535'e ayarlayın. Yüzeyleri 1.0 vokselin üzerinde tuttuğunuzdan emin olun.