JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 2:56 dk • May 29th, 2025
Beyin omurilik sıvısı veya BOS ile dolu boşluklar olan ventrikülleri ortaya çıkarmak için bir fare beyninin sagital bölümünü alın.
Ventrikülleri kaplayan ependimal hücreler, dolaşımını kolaylaştırmak için BOS'u iten hareketli kirpiklere sahiptir.
Bölümü, siliyer aktiviteyi sürdürmek için besin açısından zengin bir ortam içeren cam tabanlı bir tabağa yerleştirin.
Görüntüleme sırasında hücre canlılığını korumak için çanağı diferansiyel girişim kontrastının veya DIC'nin iklim kontrollü odasına aktarın.
DIC mikroskobu, polarize ışığı bölmek için bir prizma kullanır ve onu numuneden farklı yollar boyunca yönlendirir.
Numune boyunca kırılma indisindeki değişiklikler, kirişler arasında faz farklılıklarına neden olur.
İkinci bir prizma, ışınları yeniden birleştirerek, üç boyutlu bir efektle yüksek kontrastlı bir görüntü üreten girişim oluşturur ve ince yapıların görünürlüğünü artırır.
Hareketli kirpiklere sahip fonksiyonel ependimal hücreleri, çırpmaları tarafından üretilen kabarcık hareketini gözlemleyerek bulun.
Yüksek kontrastlı DIC görüntüleme kullanarak, atma frekanslarını ölçmek için kirpikleri kaydedin.
Bölümleri görüntülemek için, beyin dilimlerini 1 mililitre yüksek glikozlu ortam içeren 30 milimetrelik cam tabanlı kültür kaplarına yerleştirin ve kapalı mikroskop odası ortamını 37x objektif yağa daldırma lensi kullanarak 5 santigrat derece ve% 60 karbondioksite ayarlayın.
Ardından, düzenli DIC ile iletilen ışığa sahip hücrelere odaklanın. Ardından, DMEM kabarcık hareketinin yönünü takip ederek, hareketli ependimal kirpiklerin konumuna bir kılavuz olarak, beynin lateral ventrikülünde hareketli kirpiklere sahip sağlıklı hücreleri içeren bir alanı seçmek için DIC filtresini kullanın. Ependimal kirpiklerin tanımlanmasından sonra, ışığı ayarlayın ve tatmin edici bir görüntü elde etmek için odaklanın.
Ardından, görüntüleme yazılımında canlı görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Örneğin, burada 24 bit görüntüler elde ediliyor, kamera gruplaması 1 çarpı 1 olarak ayarlanıyor, 60x objektif ve 5 ila 10 milisaniyelik pozlama süresi ile birleştiriliyor.
Minimum pozlama süresi için mikroskop açıklığını en uygun seviyeye getirin ve DIC görüntülerini toplayın. Gecikme olmadan hızlı ve anında görüntü elde edilmesini sağlamak için kameraya gelen canlı görüntü akışını gözlemleyin. Kirpiklerin atma hızı daha sonra yeterli bir görüntü kontrastı elde etmek için minimum pozlama sürelerinin gerekliliğine bağlı olarak hesaplanabilir.