Miyelinli Fare Aksonlarında Nörofilament Taşınmasının Floresan Fotoaktivasyon Görüntülemesi

Ters çevrilmiş bir mikroskop tablasına yerleştirilmiş bir perfüzyon düzeneği ile başlayın.

Perfüzyon düzeneği, sürekli salin perfüzyonlu bir lamel ile bir mikro su kemeri lamı arasına sabitlenmiş diseke bir periferik sinir içerir.

Sinirin miyelinli aksonları, yeşil florofor etiketli nörofilamentleri ifade eder.

Parlak alan aydınlatmasını kullanarak miyelinli aksonlara odaklanın.

Konfokal moda geçin, yüksek lazer gücüyle foto ağartıcı, ardından düşük lazer gücü kullanarak düşük otofloresan bir referans görüntüsü yakalayın.

Fotoaktivasyon penceresi uzunluğunu tanımlamak için akson boyunca paralel çizgiler çizin. Dikdörtgen bir etkinleştirme bölgesi oluşturmak için bunu bir kılavuz olarak kullanın.

Yeşil florofor etiketli nörofilamentleri aktive etmek için bu bölgeyi belirli bir dalga boyu ile aydınlatın ve floresan olmalarına neden olun. Görüntüyü elde edin.

Etkinleştirmeden sonra hızlandırılmış görüntüler yakalayın.

Zamanla, floresan nörofilamentler her iki yönde hareket eder ve bitişik yan bölgelere yayılır.

Aktivasyon bölgesine bitişik yan bölgelerde floresan görünümü, nörofilament taşınmasını doğrular.

Sinirin proksimal ucunu kavrayın ve yavaşça bir örtü kızağı üzerine yatırın. Ardından, hafif bir gerginlik altında düzeltin. Mikro su kemeri sürgüsünü, yivli sürgü aşağı gelecek şekilde sinirin üzerine yerleştirin ve akış yönünü sinire paralel olarak konumlandırın. Kapak kızağını ve mikro su kemeri tertibatını ters çevirin ve sürgü dış contanın karşısına gelecek şekilde perfüzyon odası muhafazasına yerleştirin.

Perfüzyon haznesini sabitlemek için metal muhafazaya yerleştirin ve kilitleme halkasını döndürün. Tuzlu su şırınga pistonuna yavaşça bastırın ve perfüzyon odasını doldurun. Giriş ve çıkış borularını, çıkış şişesini ve şırıngayı kurulum ve görüntüleme sırasında her zaman haznenin üzerinde yukarıda tutun. Perfüzyon tertibatını ters çevrilmiş bir mikroskop aşamasına aktarın ve salin şırıngasını şırınga pompasına monte edin. Ardından motoru çalıştırın ve hızı dakikada 0,25 mililitrelik bir akış hızı için ayarlayın.

Hat içi çözelti ısıtıcısını bağlayın ve 37 santigrat dereceye ayarlayın. Objektif ısıtıcıyı bağlayın ve 37 santigrat dereceye ayarlayın. Objektife yağ sürün ve perfüzyon odasını sahne montajına yerleştirin. Hazne ısıtıcı pedine yağ sürün ve perfüzyon haznesine takın. Ardından bağlayın ve 37 santigrat dereceye ayarlayın.

Perfüzyon haznesini s'ye kilitleyintage adaptör ve objektif yağı haznenin alt tarafındaki kapak kızağı ile temas ettirin. Kapak kayma yüzeyine en yakın sinirin alt yüzeyindeki akson tabakasına odaklanmak için parlak alan aydınlatmasını kullanın. Miyelinli aksonlar, kontrast artışı olmadan parlak alan ile iletilen ışık aydınlatması altında görülebilen bir miyelin kılıfının varlığı ile tanımlanabilir.

Sinirin yönlülüğünü kaydeden bir parlak alan referans görüntüsü elde edin. Ardından, 488 nanometre lazer ve fotoaktif GFP için uygun bir emisyon filtresi kullanarak konfokal bir görüntü elde edin. Lazer gücünü normal görüntüleme gücünün yaklaşık beş katına ayarlayın ve üç ila dört dakikalık pozlama süresine sahip bir görüntü elde edin. Ardından, ağartma adımından sonra aktivasyon öncesi otofloresanı kaydetmek için başka bir konfokal görüntü elde edin.

Parlak alan görüntüsünün istenen etkinleştirme penceresi boyutuna eşit uzunlukta aksonlara paralel bir çizgi çizin. Bu çizgiyi kılavuz olarak kullanarak, aksonlara dik görüş alanı boyunca dikdörtgen bir ilgi alanı çizin. 405 nanometre ışıkla desen uyarımı yaparak bu bölgedeki GFP floresansını etkinleştirin ve aktivasyondan hemen önce ve hemen sonra bir görüntü elde edildiğinden emin olun. Etkinleştirme tamamlandığında, bir dakikalık bir zamanlayıcı başlatın. Söndüğünde, hızlandırılmış bir seri edinmeye başlayın.