Bir Fare Yavrusunda Nöronal Morfolojiyi Görüntülemek için İki Foton Mikroskobu

İki fotonlu mikroskop için uyarma ışığını ayarlayarak başlayın.

Dairesel bir cam görüntüleme penceresi ve kafatasına implante edilmiş bir kafa plakası ile anestezi uygulanmış bir transgenik fare yavrusu alın.

Nöronlar, görüntülemeyi kolaylaştırmak için kırmızı floresan proteinleri eksprese eder.

Cam görüntüleme penceresini temizleyin ve yavruyu iki fotonlu görüntüleme aşamasına sabitleyin.

Yavrunun kafasını ayarlayarak görüntüleme penceresini mikroskop objektifi ile hizalayın.

Yavrunun vücut ısısını korumak için bir ısıtma yastığı kullanın.

Anestezik akış hızını ayarlayın.

Lamel üzerine bir damla su uygulayın, ardından mikroskobun objektif merceğini indirin.

İki foton mikroskobu, floresan proteinleri aktive etmek için iki ışık fotonu kullanır ve minimum arka plan gürültüsü ve fotoağartma ile ayrıntılı nöronal görüntülemeye izin verir.

Yapılarını görselleştirmek için nöronların çeşitli derinliklerdeki görüntülerini yakalayın

Son olarak, büyümeyle ilgili morfolojik değişiklikleri incelemek için nöron projeksiyonları da dahil olmak üzere nöronun üç boyutlu bir temsilini oluşturmak için görüntüleri yığınlayın.

Görüntülemeye başlamak için önce iki fotonlu lazer dalga boyunu ayarlayın. RFP uyarımı için 1.000 nanometrelik bir dalga boyu kullanın. Kapak kaymasının yüzeyini %70 etanol ile silin. Anestezi uygulanmış yavruyu, titanyum çubuğu kullanarak görüntüleme aşamasındaki titanyum plakaya takın. Kafayı, kapak kayması objektif merceğe paralel olacak şekilde ayarlamak için açıölçer aşamasını kullanın.

37 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısıtma yastığı kullanarak görüntüleme sırasında yavrunun vücut ısısını koruyun ve izofluran konsantrasyonunu %0,7 ila %1'e düşürün. Görüntüleme aşamasını iki fotonlu mikroskobun 20X objektif merceğinin altına yerleştirin. Kapak fişinin üzerine bir damla su sürün.

Yazılımı, 1,4 mikron aralıklarla z-yığını görüntüleri alacak şekilde ayarlayın. Dördüncü katman nöron görüntüleme için, tüm dendritik morfolojiyi görüntülemek için z genişliğini 150 ila 300 mikron arasında ayarlayın. Nöronal morfolojiyi gösteren net görüntüler elde etmek için yavaş tarama ve ortalama alma kullanın.

Tüm dendritik morfolojiyi elde etmek genellikle 20 dakikadan fazla sürer.