JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:54 dk. • May 29th, 2025
Hareketsizleştirilmiş bir transgenik Drosophila'yı, başı açıkta kalacak şekilde bir floresan mikroskobu aşamasında bir kayıt odasında sabitleyin.
Sineğin mantar gövdesi, önceden yüklenmiş bir kofaktör tarafından aktive edilen kalsiyuma duyarlı biyolüminesan füzyon proteinini ifade eden nöronlardan oluşur.
Odaya bir perfüzyon tüpü bağlayın. Kaliks ve medial loblara odaklanarak floresan mantar gövdelerini bulun. Drenajı tampon ile onaylayın. Görüntüleme
parametrelerini ayarlayın ve kaliks ve medial loblara odaklanın. Karanlıkta, uyarıcı maruziyetinden önce mantar cisimlerinin temel floresan görüntülerini elde edin.
Nikotinik asetilkolin reseptörlerini aktive etmek, kalsiyum akışını ve biyolüminesan ışık emisyonunu tetiklemek için kalsiyum içeren tamponda nikotin perfüz
.Temel koşulları eski haline getirmek için tamponla yıkayın.
Nöronları depolarize etmek, hücre içi kalsiyum salınımını ve biyolüminesan sinyal emisyonunu tetiklemek için potasyum klorür perfüze.
Temel koşulları eski haline getirmek için tamponla yıkayın.
Kaliks ve medial loblardaki uzamsal ve zamansal kalsiyum aktivitesini değerlendirmek için görüntüleri analiz edin.
- Ardından, numuneyi mikroskop altındaki yuvaya yerleştirin ve büyütmeyi 5x'e ayarlayın. Ardından, perfüzyon tüpünü delinme yoluyla kanala yerleştirin. Mikroskobu floresan moduna ayarlayın ve ardından ortalayın ve mantar gövdelerini odak noktasına getirin. Mantar gövdeleri odaklandıktan sonra büyütmeyi 20x olarak değiştirin. Görüntüyü yeniden ortalayın ve odağı ayarlayın.
Ardından, drenaj aparatını drenaj havuzunun üzerine yerleştirin ve drenaj şöntünün yüksekliğini, uç drenaj havuzunun hemen üzerinde olacak şekilde ayarlayın. Ardından, yeterli drenaj olup olmadığını kontrol etmek için numuneyi Ringer solüsyonuyla 30 saniye boyunca yıkayın. Son olarak, cihazı herhangi bir dış ışıktan yalıtmak için kalkanı aşağı çekin.
Photon Imager programındaki otomatik sistemi kullanarak, odakta ince ayarlamalar yapın ve mantar gövdelerinin referans floresan görüntüsünü alın. Kaliks, hücre gövdeleri ve medial loblar üzerindeki ilgi alanı kutularının konumunu, kutulara tıklayarak ve Control'ü basılı tutarken yerlerine sürükleyerek ayarlayın.
Şimdi, yaklaşık 5 ila 10 dakika boyunca temel değerleri kaydedin. Ardından, nikotin akışını başlatmak için anahtarı çevirin. Aynı zamanda Enter tuşuna basın ve nikotin akışının başladığını belirten bir not ekleyin. Bir dakika sonra akışı durdurun ve günlüğe akışın durdurulduğunu belirten başka bir not alın. Ardından, numuneyi Ringer solüsyonu ile beş dakika yıkayın.
Numune iyileşirken, yıkamayı kapatın, zamanlayıcıyı beş dakika daha ayarlayın ve potasyum klorür akışını başlatmaya hazırlanın. Başlamaya hazır olduğunuzda, potasyum klorür akışını başlatın ve numune günlüğüne 100 milimolar potasyum klorür başlangıcını girin. Bir dakika sonra akışı durdurun ve numune günlüğüne kapatılmış potasyum klorürü girin. Ardından, numuneyi Ringer solüsyonu ile bir dakika yıkayın ve mikroskobu floresan moduna geçirin. Son bir floresan görüntü alın ve ardından Ringer solüsyonunu kapatın ve numuneyi çıkarın.