Bir Zebra Balığı LarAva'da İki Foton Mikroskobu Kullanılarak Hedeflenen Nöronal Ablasyon

Agaroz içinde hareketsiz hale getirilmiş ve anestezik bir çözelti içeren bir Petri kabına yerleştirilmiş anestezi uygulanmış bir transgenik zebra balığı larvası ile başlayın.

Ayrıntılı görüntüleme için iki foton kullanan iki fotonlu bir lazer mikroskobu altına yerleştirin.

Görüntüleme sınırlarını belirlemek için beynin üst ve alt katmanlarına odaklanın.

Lazer tedavisinden önce nöronları gözlemlemek için çeşitli derinliklerde görüntüler yakalayın.

Odağı ilgilenilen bölgeye ayarlayın ve nöronlara odaklanmayı iyileştirmek için çerçeve boyutunu ayarlayın.

İki fotonlu lazeri kullanarak nöronları seçin ve ışınlayın.

Lazer, lokalize ısıyı indükleyerek çevredeki dokuya minimum hasarla nöronal ölümle sonuçlanır. Görüntüyü yakalayın.

Floresan değişikliklerini değerlendirmek için tedavi öncesi ve sonrası görüntüleri karşılaştırın.

Nöronları daha derin düzlemlerde yeniden odaklayın ve ilgilenilen bölgedeki tüm nöronları tedavi etmek için ışınlamayı tekrarlayın.

Görüntüyü yeniden yakalayın ve işlem öncesi görüntüyle karşılaştırın. Lazer tedavisinden sonra floresan kaybı, başarılı nöronal ablasyonu doğrular.

Agaroz gömülü larvayı 2 fotonlu lazer taramalı mikroskop altına yerleştirin ve mikroskopi sistemini başlatın. Görüntü alma yazılımını açın ve Lazer sekmesi altında, lazeri açmak için açık düğmesine tıklayın. Lazerin durumunun Meşgul'den Mod Kilitli'ye değişmesini bekleyin.

Kanallar sekmesinde, lazerin dalga boyunu EGFP ablasyonu için 880 nanometre veya GcAMP ablasyonu için 800 nanometre olarak ayarlayın. Lens tabancasını manuel olarak hareket ettirerek 20x objektif lensini seçin. Ardından, Bul sekmesine tıklayın. Optik yolları değiştirmek için GFP'ye tıklayın ve floresansı doğrudan gözle görüntüleyin. Zebra balığı larva beynini görüş alanında ortalayın. Ardından, iki foton mikroskobuna geri dönmek ve lazer gücünü ve kazancını ayarlamak için Edinme sekmesine tıklayın.

Ablasyon öncesi koşulun bir kaydı olarak, Z-Stack seçeneğini seçmek için Z-Stack'e tıklayın. Ardından, larva beyninin ventral ucuna odaklandıktan sonra, alt sınırı ayarlamak için Önce Ayarla düğmesine tıklayın. Ve beynin en sırt yüzeyine odaklandıktan sonra, Son Ayarla Üst sınırı ayarlamak için düğmesine basın. Son olarak, Z-Stack görüntü alımını çalıştırmak için Denemeyi başlat düğmesine tıklayın.

Ardından, lens tabancasını manuel olarak hareket ettirerek 63x objektif lensini seçin. Ardından, epifloresan mikroskobuna geçmek için Bul sekmesine tıklayın. Gözle kesilecek hücreleri ortalayın. Ardından, lazer tarama mikroskobuna geri dönmek için Edinme sekmesine tıklayın.

Edinme Modu sekmesinde, çerçeve boyutunu 256 x 256 olarak ayarlayın. Canlı'ya tıklayın ve ilgilendiğiniz nöronları gözlemleyin. Daha sonra, en sırt tarafından başlayarak, ablasyon yapılacak hücrelerin odakta olduğu bir odak düzlemi bulun. Bölgeler işlevini kullanarak, her nöronda çap olarak hücre boyutunun yaklaşık üçte biri kadar küçük dairesel bir alanı ROI olarak işaretleyin.

Tarama hızını 256 x 256 piksel başına 13,93 saniye olarak ayarlayın, bu da piksel başına yaklaşık 200 mikrosaniye veya yarım mikron başına 200 mikrosaniye lazer bekleme süresine karşılık gelir. Ayrıca, yineleme döngüsünü 4 tekrara ayarlayın. Zaman serileri ve ağartma işlevlerini yürütmek için Denemeyi Başlat'a tıklayın. Hedeflenen hücrelerdeki floresanın gittiğinden emin olmak için ablasyondan önceki görüntüyü zaman serisi döngüsündeki ablasyondan sonraki görüntüyle karşılaştırın.

Ardından, odak düzlemini biraz daha derine hareket ettirin ve ablasyona uğramamış hücrelerin göründüğü bir sonraki odak düzlemini seçin. Ağartma işlevini az önce gösterildiği gibi gerçekleştirin ve ilgilenilen nöral yapıdaki tüm hücreler kesilene kadar işlemi tekrarlayın. Ablasyondan sonra, hücrelerde kaldırılmış floresan olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse lazer ışınlamasını tekrarlayın.