Fare Retina Koni Fotoreseptörlerinde Kalsiyum Dinamiğini İzlemek için İki Foton Mikroskobu

İki fotonlu bir mikroskop altında zara monte fare retina dokusu içeren bir lamel yerleştirin.

Doku, koni fotoreseptörlerinde FRET bazlı bir kalsiyum biyosensörü eksprese eder.

Suya daldırma hedefi kullanarak dokuya odaklanın.

Arka plan aydınlatması altında, koni akson terminalleri depolarize kalır ve kalsiyum akışına izin verir.

Hücre içi kalsiyum bağlanması, biyosensörün konformasyonunu değiştirerek verici ve alıcı floroforları daha yakın hale getirir.

İki fotonlu görüntülemeye başlayın.

Mikroskobun lazeri, düşük enerjili yakın kızılötesi ışığı dokuya odaklar.

Lazerin odak noktasında, iki foton aynı anda biyosensörü uyararak vericiden alıcıya enerji transferini tetikler.

Bu, donör floresansını azaltırken alıcı floresansını arttırır.

Floresan oranını hesaplayın.

Ardından, konileri hiperpolarize etmek ve hücre içi kalsiyum seviyelerini azaltmak için ışık stimülasyonu sağlayın.

Bu, biyosensörün konformasyonunu tersine çevirir, vericiden alıcıya enerji transferini engeller ve floresan oranını düşürür.

Koni akson terminallerinde ışıkla uyarılmış kalsiyum dinamiklerini analiz etmek için yanıtları kaydedin.

Tutma odasından kayıt odasına bir dilim aktarın ve hemen karboksijenli hücre dışı bir çözelti ile perfüze etmeye başlayın. Kayıt odasında dakikada 2 mililitre perfüzyon akış hızını ve 37 santigrat derece sıcaklığı koruyun. Retina dilimini bulmak için 20x, 0,95 NA suya daldırma objektifi ve kayıt odasının altında bir kızılötesi LED ile birlikte bir CCD kamera kullanın.

Üretici tarafından belirtildiği gibi iki fotonlu görüntüleme sistemini başlatın. Ardından, lazeri açın ve 860 nanometreye ayarlayın. ECFP ve sitrinin floresan görüntülemesi için iki algılama kanalını açın. Ardından, görüntü elde etme yazılımını kullanarak, taramak için iki fotonlu mikroskobu kontrol edin ve kayıt için bir sıra koni terminali seçin. Görüntü alımını 128 x 16 piksel görüntü veya benzer bir yapılandırma olarak ayarlayın.

Dış segmentlerdeki fotopigmentlerin ağartılmasını önlemek için taranan alanı koni terminalleriyle sınırlayın. Lazeri açın. Işık uyaranları sunmadan veya farmakolojik ajanlar uygulamadan önce konilerin tarama lazerine ve uyaran arka plan ışığına 20 ila 30 saniye uyum sağlamasına izin verin. Şimdi, keyfi uyaranların sunumuna başlayın. Uyaranlar, özelleştirilmiş yazılım tarafından kontrol edilen bir mikroişlemci kartı kullanılarak iki LED'in yoğunluğunun zaman içinde modüle edilmesiyle üretilir. Ardından, ilgili görüntü elde etme yazılımını kullanarak iki floresan kanalını aynı anda kaydetmeye başlayın.