JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 3:06 dk • June 17th, 2025
Stereomikroskop altında oksijenli fizyolojik bir tampon içeren bir montaj odasında anestezi uygulanmış transgenik zebra balığı larvaları ile başlayın.
Beyindeki beyincik, floresan sitoplazmik proteinleri eksprese eden genetik olarak değiştirilmiş Purkinje nöronları içerir.
Fazla ortamı çıkarın, ardından stabil görüntüleme için larvaları hareketsiz hale getirmek için erimiş agaroz ekleyin.
Beyincik'i görselleştirmek için larvaların sırt tarafını yukarı doğru yönlendirin.
Katılaştıktan sonra fazla agarozu kesin. Bir cam iğne kullanarak, beynin üzerindeki pigmentli cildi açığa çıkarmak için eksize edin.
Ters mikroskop altında görüntülemek için agaroz bloğunu erimiş agaroz içeren bir görüntüleme odasına çevirin.
Nöronal fonksiyonu korumak için fizyolojik tamponu ekleyin.
Odayı ters çevrilmiş konfokal bir mikroskop altına yerleştirin. Floresan proteinleri uyarmak için uyarma ışığı uygulayın ve etiketli nöronların görselleştirilmesini sağlayın.
Pigmentli cilt hücreleri, çıkarılmazsa, uyarma ışığını dağıtır ve emer, bu da floresan yoğunluğunu azaltır.
Derinin çıkarılması, floresan yoğunluğunu artırmak için ışık penetrasyonunu iyileştirir ve nöron görselleştirmesini kolaylaştırır.
Larvaları gömmek için, anestezi uygulanmış larvaları stereomikroskop altında bir montaj odasına aktarmak için bir Pasteur pipeti kullanın. Herhangi bir larva hala hareket edebiliyorsa, balıklar tamamen hareket edemeyecek duruma gelene kadar deney için balığı kullanmayın. Larva hareketsiz olduğunda, fazla ortamı dikkatlice çıkarın ve hemen larva üzerine en az 1 mililitre düşük erime noktalı agaroz ekleyin.
Zebra balığını, sırt bölgesi yukarı bakacak şekilde agarozun yüzeyine mümkün olduğunca yakın olacak şekilde yönlendirin. Larvalar ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak görüntülenecekse, katılaştıktan sonra larvaları içeren agarozu küçük bir küboid blok halinde kesin. Beyni görüntüleme için açığa çıkarmak için, ilgilenilen beyin bölgesi üzerindeki fazla agarozu gerektiği gibi kesin ve dokuya çok derinlemesine nüfuz etmeden, ilgilenilen bölgenin yakınında ancak üzerinde değil, deriden küçük bir kesi yapmak için bir cam iğne kullanın.
İğneyi cilt yüzeyinin hemen altında zar zor hareket ettirerek, ilgilenilen bölgenin üzerindeki cilt çıkarılana veya bir kenara itilene kadar ilgilenilen bölgenin etrafında çok küçük kesikler atmaya devam edin. Doku tüm embriyolardan çıkarıldığında, ters çevrilmiş bir mikroskobun önceden hazırlanmış bir görüntüleme odasına küçük bir damla düşük erime noktalı agaroz ekleyin ve küboid agaroz bloğunu görüntüleme odasındaki agaroz damlası üzerine 180 derece çevirmek için küçük bir spatula kullanın. Agaroz katılaştığında, görüntüleme odasını taze ACSF ile doldurun ve larvaları görüntülemeye başlayın.