Fare Retinal Eksplantlarında Nöronal Dendritik Dinamiklerin Hızlandırılmış Konfokal Görüntülenmesi

Bir membran filtreye monte edilmiş ve konfokal mikroskop altında bir inkübasyon odasına yerleştirilmiş canlı bir doğum sonrası fare retinal eksplant ile başlayın.

Retina, yıldız patlaması amakrin internöronlarının zarlarında bir floresan proteini eksprese etmek için transfekte edilir.

Stabilize etmek için retina üzerine önceden ıslatılmış bir numune ağırlığı yerleştirin.

Hazneyi tamponla doldurun.

Nöronal canlılığı korumak için odadaki optimum tampon akışını ve sıcaklığını koruyun.

Görüntüleme odasına bir suya daldırma hedefi yerleştirin.

Epifloresan görüntülemeyi başlatın.

Objektif boyunca yönlendirilen lazer ışığı, amakrin hücrelerindeki floresan proteini uyarır.

Yayılan floresan aynı amaç doğrultusunda yakalanır ve etiketli amakrin hücrelerinin görselleştirilmesine izin verir.

Görüntüleme için parlak bir floresan hücre tanımlayın.

Görüntüleme parametrelerini ayarlayın.

Tüm dendritik morfolojinin 3D görselleştirmesini elde etmek için birden fazla Z düzleminde görüntü yakalayın.

Zaman içinde dendritik morfolojideki değişiklikleri izlemek için hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin.

Canlı görüntüleme inkübasyon odasını monte edin ve oksijenli aCSF ile doldurun. Sıcaklığın 34 santigrat derecenin üzerine çıkmadığından emin olarak pompayı ve sıcaklık kontrol cihazını açın. Oda sıcaklığının stabilize olması bir saat kadar sürebilir. Retina diseksiyonuna başlamadan önce inkübasyon odasının kurulması önerilir. Sabit hazne sıcaklığı, numune kaymasını azaltmaya yardımcı olur.

Retina düz höyüğünü perfüzyon odasına aktarmak için pompayı durdurun ve odadaki aCSF'yi çıkarın. Ardından, retinal düz montajlı MCE diskini inkübasyon odasına yerleştirin. Yüzey gerilimini kırmak için bir numune ağırlığını önceden ıslatın, ardından numune kaymasını azaltmak için numune ağırlığının MCE kağıdına yerleştirildiğinden emin olarak düz höyüğün üzerine yerleştirin. Hazneyi ısıtılmış aCSF ile tekrar doldurun ve aCSF'yi dakikada yaklaşık 1 mililitre olarak dolaştırın.

Burun parçasını 25 kez suya daldırma objektifi ile görüntüleme odasına yerleştirin. Epifloresan ışık kullanarak ilgilenilen etiketli hücreleri tarayın ve ilgilenilen dendritik özellikleri yakalamak için görüntüleme sesini ayarlayın.

Hem aşırı doygun hem de az doygun pikselleri tanımlayan bir arama tablosu kullanarak, lazer gücünü hiçbir pikselin aşırı doygunluğuna erişmeyecek şekilde ayarlayın. 3D görüntüleme hacmini elde edin ve istenen kare hızında alımı tekrarlayın. Görüntüleme hacmi, numune kaymasını telafi etmek için her bir zaman noktası arasında ayarlanabilir.