Bir Fare Yavrusu Striatumunda Gen Manipülasyonu için Viral Bir Vektörün Stereotaktik Mikroenjeksiyonu

Kırmızı floresan proteini veya RFP ekspresyonunu bloke eden loxP ile çevrili bir STOP kaseti taşıyan genetiği değiştirilmiş bir fare yavrusunu ele alalım.

Yavruyu özel yapım bir stereotaksik çerçeveye sabitleyin ve anesteziyi sürdürmek için buzla örtün.

Saç derisini dezenfekte edin ve lambdayı referans noktası olarak işaretleyin.

Enjeksiyon iğnesini lambdaya göre striatal koordinatlara hizalayın ve kafatasını delin.

İğneyi kafatası yüzeyine geri çekin, ardından hedef derinliğe yerleştirin.

Boya karışımlı viral vektörü kontrollü bir oranda striatuma enjekte edin. Vektör, yeşil floresan proteinleri veya GFP'leri ve Cre rekombinazı kodlar.

Çözeltinin geri akışını önlemek için iğneyi yavaşça geri çekin.

Yavruyu çıkarın ve iyileşmeye izin verin.

Striatal hücrelerde, virüs genomunu serbest bırakarak Cre rekombinaz ve GFP'nin ekspresyonunu sağlar. Cre, loxP ile çevrili STOP kasetini eksize ederek RFP ifadesini etkinleştirir.

Eşzamanlı GFP ve RFP ekspresyonu, başarılı gen manipülasyonunu doğrular.

Yavruyu eldivenle birlikte baş tepsisine yerleştirin ve hipotermi anestezisini sürdürmek için lateks manşonun etrafına biraz kırılmış buz koyun. Ardından yavrunun kafasını %70 etanol ile ovalayın ve lambda dönüm noktasını bulun. Bir işaretleyici ile işaretleyin. Ardından iğne ucunu lambdaya doğrultun ve ön, arka ve medial lateral koordinatları sıfıra ayarlayın.

Daha sonra, bir beyin atlasına danışarak, enjeksiyon kolunu hedef bölgeye hareket ettirin. Örneğin, P2 yavrularının striatumu lambdanın 2.4 milimetre önünde, orta hattın her iki tarafında 1.0 milimetre ve ventralde 1.7 milimetredir. Ardından, bir kalem kullanarak PE10 tüpü üzerindeki hızlı yeşil boyanın konumunu işaretleyin. Daha sonra, iğne ucu kafatasının yüzeyine temas edene kadar iğneyi deriden ve kafatasından yavaşça nüfuz etmeye başlayın.

Dorsal ventral koordinatı sıfır olarak ayarlayın. Ardından iğneyi yavaşça hedef bölgeye indirin. Yerleştirildikten sonra, parankimin normal şekline dönmesine izin vermek için bir dakika bekleyin. Daha sonra mikroenjeksiyon programını dakikada 100 nanolitre hızında çalıştırın. Enjeksiyon sırasında, PE tüpteki hızlı yeşil boyanın hareketini izleyin.

İğne ucu kafatasının yüzeyine temas edene kadar iğneyi deriden ve kafatasından yavaşça nüfuz ettirmek çok önemlidir. Enjeksiyon sırasında, Hızlı Yeşil boyanın PE boruda hareket etmesini izlemek zorunludur.

Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, bir dakika bekleyin ve ardından iğneyi yavaşça nüfuz eden DV derinliğinin yarısına getirin. Ardından, iğneyi yavrunun kafasından yavaşça çekmeye devam etmeden önce 30 saniye daha bekleyin.

Enjeksiyonun tamamlanmasından sonra, iğneyi yavaşça nüfuz edilen DV derinliğinin yarısına getirmeden önce bir dakika beklemek, ardından iğneyi yavrunun kafasından yavaşça çekmeden önce 30 saniye daha beklemek önemlidir.

Hedeflenen tüm bölgelere enjekte edildikten sonra, yavruyu 33 santigrat derecelik bir inkübatörde 20 dakika ısıtın.

Sternal yaslanma kendini kazanana kadar yavruyu her beş dakikada bir kontrol edin. Ardından yavruyu barajına geri koyun.