Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Çevre metabolomik için düşük yoğunluklu Planktonik topluluklardan Metabolitlerinin Konsantrasyon

Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi, çevresel metabolomik araştırmaları için çeşitli belirgin avantajlar sunar, ancak bu prosedürde nispeten düşük hassasiyete sahiptir. NMR için uygun olan platonik sistemlerden tüm topluluk metabolitlerinin konsantrasyonu ve ekstraksiyonu için bir filtrasyon yöntemi rapor edilmiştir. Bu işlem, öncelikle çıkarılabilir maddelerin uzaklaştırılmasıyla örnek toplama için filtrelerin özel olarak hazırlanmasıyla gerçekleştirilir.

Prosedürün ikinci adımı, doğal veya deneysel örneği filtrelere süzmektir. Prosedürün üçüncü adımı, örnek materyalini liyofilize etmek ve metabolitleri ekstre etmektir. Prosedürün son adımı ise örnekleri nükleer manyetik rezonans spektroskopisi kullanarak analiz etmek ve verileri uygun şekilde entegre etmektir.

Nihayetinde, metabolomik ve transams yaklaşımları aracılığıyla, çevresel gradyanlar boyunca veya deneysel manipülasyonlara yanıt olarak doğal örneklerdeki metabolik değişimleri gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin santrifüjleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, toplam topluluğun örneklenebilmesi ve düşük yoğunluklu örnekler için daha büyük örnek hacimlerinin mümkün olmasıdır. Bu yöntem, mikroorganizma büyümesinin çevresel değişimlere nasıl yanıt verdiği gibi, çevresel metal karışımları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürün gösterimi, kendi laboratuvarımda gerçekleştirilecektir.

Bu protokole, cımbız kullanarak temiz bir 500 mililitre Pyrex beher içine filtreleri yerleştirerek başlayın. Filtrelerin birbirine yapışmasını önlemek için filtreleri distile su ile kaplayıp ön durulama yapmak üzere iyice çalkalayın. Suyu dökün ve durulama işlemini iki kez tekrarlayın.

Son durulamadan sonra, beherin içine 300 mililitre Milli Q su ekleyin ve filtreleri otoklavlayın. Filtreler otoklavlandıktan sonra, Milli Q suyu dökün ve daha önce yaptığınız gibi, ancak bu kez Milli Q su kullanarak filtreleri üç kez durulayın.

Ayrı ayrı filtreleri, cımbız yardımıyla alüminyum folyo gibi temiz ve kuru bir yüzeye yerleştirin ve uygun bir sıcaklıkta kurutun. Örneğin, 37 °C'de veya havada kurutun; filtreler artık bu protokolün uygulanması için kullanıma hazırdır. Cam destekli 25 mm mikroanaliz filtre kolonları ve mekanik bir pompa ile donatılmış, aseptik teknik kullanılarak uygulanan üçlü bir Millipore paslanmaz çelik filtre manifold sistemi kullanılır.

Filtre kolon tabanına tek bir 25 milimetre filtre yerleştirin. Kolonu takın ve düzeneği beraberce sıkıştırın. Yüksek besinli bir mikrokosmodan elde edilen 15 mililitre numuneyi kolona yükleyin.

Hücre yıkımını en aza indirmek için filtre manifoldundaki stop vanasını açın ve pompa filtresini düşük basınç altında çalıştırın. Düşük yoğunluktaki örnekler için art arda su eklemeleri gerekebilir. Su eklemeleri arasında filtrenin uzun süre kuru kalmamasına dikkat edin.

İkinci olarak, deniz örneklerindeki kalıntı paramanyetik tuzlar azaltılabilir ve isteğe bağlı olarak tatlı su ile durulama yapılabilir. Filtreleme tamamlandığında, pompayı kapatın ve filtre altında negatif basınç kalmaya devam etmesi için vanayı açık bırakın. Kelepçeyi ve filtre kolonunu tek elinizle çıkarın.

Filtreyi tutmak için temiz pensler kullanın. Filtreyi kendi üzerine katlayın ancak diğer elinizle kat izi oluşturmayın. Filtreyi sabit tutmak için steril iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünün ağzını kullanın.

Filtreyi iki mililitrelik tüpe yerleştirin ve örnek tarafı içe bakacak şekilde açılması için serbest bırakın. Suda çözünür metabolitleri ekstrakte etmek için hemen sıvı nitrojen içinde dondurun. Önce örnekleri gece boyunca veya liyofilizasyon sonrası en az 10 saat boyunca liyofilize edin, ardından her tüpe bir paslanmaz çelik kırıcı ekleyin.

Standartlaştırılmış potasyum fosfat tamponu, döteryum oksit ve DSS standardından 750 µL ekleyin. Hücre materyalini filtreden uzaklaştırmak için örnekleri bir su banyosunda, 4 °C'de beş dakika boyunca sonike edin. Filtreleri temiz bir cımbızla çıkarın.

Hücreleri 1600 RPM'de beş dakika boyunca değirmen kırıcı kullanarak parçalayın. Ardından, 65 °C'de inkübe edin. Bir masaüstü shaker ile 15 dakika boyunca çalkalayın.

İnkübasyonun ardından, metal parçalayıcı temiz bir cımbızla çıkarın. Numuneyi 13,000 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatantı çekin ve NMR spektroskopisi için doğrudan bir NMR tüpüne aktarın.

Numuneyi buradaki NMR spektrometresine yükleyin. Numuneler, 298 Kelvin'de çalışan, üç eksenli gradyana sahip TXI probu ile donatılmış bir Bruker DRX 500 spektrometresinde analiz edilir. Mıknatısı kilitleyin (lock), ayarlayın (tune) ve şimleyin (shim).

TopSpin arayüzü ve daha önce açıklanan yöntemler kullanılarak veya gerektiğinde diğer spektrometre arayüz yazılımları aracılığıyla 1D proton NMR Spektrumları elde edin. Burada spektrumlar, 1.2 saniyelik bir tekrarlama süresine sahip Watergate puls dizisi ile kalıntı su sinyallerinin baskılanmasıyla elde edilmiştir. Mevcut örnekte, her numune için 128 transient toplanmıştır.

NMR veri dizinlerini, NMR pipe yazılımı yüklü bir kişisel bilgisayara aktarın. Ham verileri işleyin, DSS sinyalini sıfır PPM referansı olarak ayarlayın ve ardından spektrumların faz ayarını manuel olarak yapın. Spektral verileri, e-ticaret web sitesinden erişilebilen, halka açık FT two B paketini kullanarak kutucuklama (binning) yoluyla dijitalleştirin.

Binleme işlemi için RNMR veya Atomics gibi diğer yazılım araçları da kullanılabilir. Örnekler arasındaki orantılı sinyal değişimlerini göstermek için veriler toplam sinyale veya DSS sinyaline normalize edilebilir. Çıktı verileri artık, gösterilen R gibi ücretsiz yazılım paketleri kullanılarak temel bileşenler analizi veya PCA gibi ileri aşama istatistiksel analizler için kullanılabilir.

Burada, gösterilen prosedür kullanılarak elde edilen proton NMR Spektra örneği yer almaktadır. Spektralar, bir mikrokozmos deneyinin iki farklı zaman noktasına aittir ve alglerin metabolik aktiviteleri nedeniyle belirgin farklılıklar göstermektedir. Dördüncü gün spektrumu, birinci gün örneğine kıyasla, özellikle 3 ile 4:00 PM aralığında önemli ölçüde daha fazla pik yoğunluğu göstermektedir.

Bu pikler, mikrokozmos içindeki çiçeklenme aşamasındaki diyatomlar tarafından üretilen şekerlere atfedilebilir. Benzer bir deneyde, yapay ve doğal deniz suyundaki doğal plankton topluluklarının büyümesini karşılaştırmak için bend in Mr.Spectra'dan elde edilen ve ilk iki temel bileşeni gösteren bir PCA skor grafiği kullanılmıştır. Bu istatistiksel yaklaşım, çok boyutlu verileri burada iki boyutlu olacak şekilde daha basit bir formata indirger ve temel veri noktaları arasındaki yapıyı açıkça ortaya koyar.

Her iki eksen veya her biri burada daha benzerdir. İki işlem arasında belirgin metabolik farklılıklar görülebilir. Bu deneyden elde edilen veriler, multiomik analiz gerçekleştirmek için kullanılmıştır.

NMR'nin, 18 s ve 16 S-R-R-N-A genlerinin denatüre edici gradyan jel elektroforezine dayalı genomik veri topluluk kompozisyonu ile birleştirilmesi, doğal ve yapay deniz suyu mikrokozmosları arasında belirgin mikrobiyal topluluk modelleri olduğunu da göstermektedir. Doğal sistemlerden elde edilen metabolom ve genom arasındaki bu uygunluk, bu yaklaşımın kullanışlılığını kanıtlamaktadır. Bu prosedür uygulanırken, işlem sonrasında kontaminasyonu en aza indirmek için uygun bir teknik kullanılması gerektiği unutulmamalıdır.

Mikrobiyomun belirli metabolitlerle nasıl korele olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için omik seviyelerdeki korelasyon analizi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.