Gen Ekspresyonunu Değerlendirmek için Fare Omuriliğinde Subpial Gen İletimi

Anestezi uygulanmış bir fare alın, sırtını tıraş edin ve cildi dezenfekte edin.

Cildi kesin, kasları omurlardan ayırın ve kelepçeler kullanarak geri çekin.

Çatlaklar oluşturmak için vertebral laminaları delin, ardından dış omurilik zarı olan dura mater'i ortaya çıkarmak için kemik parçalarını çıkarın.

Bir iğne kullanarak, bir dural açıklık oluşturun ve omurga dokusuna doğrudan erişim için subpial boşluğa girmek için alttaki pia materini delin.

Floresan protein eksprese eden bir gen taşıyan rekombinant adeno ilişkili virüsün bir süspansiyonunu içeren bir dağıtım iğnesi alın ve süspansiyonu enjekte edin.

İğneyi geri çekin, kasları ve cildi dikin ve farenin iyileşmesine izin verin.

Virüs, nöronlar ve glial hücreler üzerindeki reseptörlere bağlanır ve endositoza uğrar.

Çekirdeğin içine girdikten sonra virüs, floresan proteinler üretmek için gen ekspresyonunu tetikler.

Subpial gen dağıtım modeli artık omurilikteki hedef gen ekspresyonunu değerlendirmeye hazırdır.

Ameliyat için hayvanı uygun şekilde uyuşturarak başlayın. İzofluran burada kullanılır. Devam etmeden önce bir pençe sıkışması tepkisi olmadığından emin olun. Sonra gözleri oftalmik merhem ile örtün. Daha sonra, hayvanın sırtını makasla tıraş edin ve cildi% 2 klorheksidin ile temizleyin.

Lomber subpial enjeksiyonlar yapılacaksa, T8 ila L1 omurlarının üzerindeki cildi bir neşter ile kesin. Ve sonra paravertebral kası T10 ila T12 omurga omurlarından ayırmak için makas kullanın. Fare omurga kelepçelerini kullanarak hayvanı standart bir stereotaksik çerçeveye monte edin. Ardından, çatlaklar oluşana kadar T10 ila T12 omurlarının laminasının her iki tarafını tıraş etmek için bir diş matkabı kullanın.

Ardından, çatlamış kemik parçalarını çıkarmak ve lomber omuriliğin dorsal yüzeyini ortaya çıkarmak için forseps kullanın. Dura artık görülebilir. Duraya 1 ila 2 milimetrelik bir kesi yapmak için 30 gauge paslanmaz çelik bir iğne kullanın.

Altta yatan pia zarının yaralanmasını önlemek için durayı dikkatlice kesmek önemlidir.

Şimdi, kesilen duranın kenarını forseps ile kavrayın ve dura açıklığını 5 milimetreye kadar uzatın. 34 gauge pia penetran iğneyi ve 36 gauge enjeksiyon iğnesini cam kılcal tutucular kullanarak iki ayrı XYZ manipülatörünün Z kollarına monte edin.

Ardından, AAV9-UBI-GFP virüsünü yüklemek için PE-10 veya PE-20 hortumuna bağlı 50 mikrolitrelik bir mikro şırınga kullanın. Virüs yüklendikten sonra, borunun ucunu enjeksiyon iğnesine bağlayın. Ardından, 8 ila 10x büyütmeye ayarlanmış bir cerrahi diseksiyon dürbününden bakarken, pia penetran iğneyi piaya 1 milimetre derinliğe indirmek için X kolunu kullanın. Penetran iğnenin açısını doku yüzeyine göre 5 ila 10 derece arasında tutun.

Pia'yı açtıktan sonra, pia penetran iğneyi subpial boşluktan çıkarmak için X kolunu kullanın. Kan damarı gibi bir yer işareti kullanarak nüfuz edilen bölgeye dikkat edin. AAV9 virüs yüklü enjeksiyon iğnesinin ucunu pia'nın nüfuz ettiği bölgeye yerleştirmek için ikinci manipülatörün X, Y ve Z kollarını hareket ettirin.

Ardından, enjeksiyon iğnesinin ucunu subpial boşluğa yaklaşık 0,5 milimetre soktuktan sonra, pia'yı yaklaşık 0,3 milimetre kaldırmak için Z kolunu kullanın, ardından iğneyi subpial boşluğa yatay olarak ilerletmeye devam etmek için X kolunu kullanın. İğneyi, yaklaşık 2 ila 3 milimetre derinlikte subpial boşluğa girene kadar ilerletin.

Ardından, AAV9-UBI-GFP virüsünü subpial boşluğa enjekte etmek için 50 mikrolitrelik mikro şırıngayı kullanın. AAV9-UBI-GFP enjeksiyonu tamamlandıktan sonra enjeksiyon iğnesini subpial boşluktan çıkarın. Floro monofilament sütür ve cerrahi klipsler kullanarak kas ve cildi kapatın. Temiz bir kafese koymadan önce hayvanın bir ısıtma yastığı üzerinde iyileşmesine izin verin.