Alexa Fluor Etiketleme Dang Virüs görselleştirme

Bu deneyin genel amacı, mikroskobik çalışmalar için dang virüsünü floresan olarak etiketlemektir. Gerekli Tamponları hazırlayın ve dang virüsünü sakaroz yastığı ile saflaştırın, Amy React Alexa akış boyasını ve dang virüsünü etiketleme tamponunda sulandırın. Dang virüsünü yüz mikromolar Alexa akışı ile etiketleyin.

Bir saat boyunca ölün ve alt reaktif ile etiketleme reaksiyonunu durdurun. Dang virüsü etiketini bir boyut dışlama sütunu aracılığıyla arındırın. Etiketli virüsü plak testi ile yeniden çoğaltın ve immünofloresan testi ile etiketleme derecesini tahmin edin.

Merhaba, ben DSO Ulusal Laboratuvarları'ndan Sam Jang, NUS lisansüstü tıp fakültesinden sonra ortaya çıkan bulaşıcı hastalıklar programında Dr.Wee'nin laboratuvarında çalışıyorum. Bugün size görüntüleme çalışmaları için Denki virüsünü Amy Reactive Alexa grip boyası ile floresan olarak nasıl etiketleyeceğinizi göstereceğim. Alexa, grip ölür, stabilite için üstündür ve floresein ve rumin görevi gibi yaygın diyetten daha az pH'a duyarlıdır, bu da onları virüsün hücresel alımı ve endozomal taşınması ile ilgili çalışmalar için ideal hale getirir.

Dang virüsü olarak adlandırılan Alexa kusuru, dang patogenezinin anlaşılmasını kolaylaştıracaktır. Öyleyse başlayalım. Etiketleme reaksiyonundan önce, taze etiketleme tamponu hazırlayın ve yazılı protokole göre reaktifi durdurun ve dang virüsünü sükroz yastığı ile saflaştırın, mililitre başına 300 milyon oluşturan birimlik bir konsantrasyon elde etmek için bir mikro santrifüj tüpündeki etiketleme tamponuna uygun hacimde saflaştırılmış dang virüsü ekleyin.

Bu, orantılı olarak ölçeklendirilebilir. Virüsün toplu etiketlemesi için. Liyofilize Alexa zemin boyasını, etiketleme reaksiyonundan hemen önce etiketleme tamponunda bir milimolar olarak sulandırın.

Bu adımdan itibaren ışığa maruz kalmayı en aza indirin. Gösteri amacıyla, Alexa zemin boyası, bir milimolar'ın 800 mikrolitrelik ışığından korunmasız bırakılacaktır. Alexa akışı, mikro Pipet ucu ile hafifçe karıştırırken seyreltilmiş dang virüsüne ölür.

saat sonra her 15 dakikada bir hafif ters çevirme ile karıştırılan ışıktan korunarak oda sıcaklığında bir saat inkübe edin, Tüpleri kısaca santrifüjleyin. Alt bölgenin 800 mikrolitresi, mikro pipetle hafifçe bakarken oda sıcaklığında bir saat daha inkübe edin. Işıktan korunur, her 15 dakikada bir hafif ters çevirme ile yapılır.

Bu arada, saflaştırma kolonunu 25 mililitre HNE tamponu ile eşitler. Bir saatlik Kuluçka işleminden sonra, etiketli virüsü sütuna uygulayın ve akışı toplamaya başlayın. Sütunu HNE arabelleği ile doldurun.

Tüm etiketli virüsler matrise girdikten sonra, ilk 2,5 mililitre akışı atın ve etiketli virüs fraksiyonunun sonraki iki mililitresini toplayın. Eksi 80 santigrat derecede saflaştırılmış etiketli virüsü ekor ve gördüm. Plak tahlili ile etiketli virüsün başlığını belirleyin.

Tipik bir deneyde, virüs başlığında on kattan daha az bir düşüş gözlenmelidir. Etiketleme sonrası, etiketleme derecesini değerlendirmek için bir immünofloresan testi yapılmalıdır. Bunu yapmak için, mililitre başına 50.000 hücre yoğunluğu elde etmek için bir hemo sitometre ve uygun hacimde hücreler kullanarak viral hücreleri numaralandırın.

Steril bir cam kapak içeren dört oyuklu bir plakada kuyucuk başına bir mililitre viral hücre görün. Uyumak. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin. Plakayı inkübatörden çıkarın ve supinatörü kuyudan aspire edin, aslında, etiketli virüsün yaklaşık bir MOI'si olan hücreler, 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca yüz mikrolitre hacimde.

İnokulumu çıkarın ve hücreleri kuyucuk başına 0,5 mililitre PBS tamponu ile yıkayın. Ruh dis ve bu işlemi iki kez daha tekrarlayın. Hücreleri, oda sıcaklığında 30 Dakika boyunca oyuk başına çoklu yükseklik için% 3 200 mikrolitre ile sabitleyin.

Hücreleri oyuk başına 0,5 mililitre PBS tamponu ile üç kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca izasyon çözeltisi ile alize edin. İnce forseps kullanarak kapak uykusunu kuyudan çıkarın.

Kapağın kenarını DPing yaparak fazla sıvıyı boşaltın. Beyaz bir kağıda karşı kaydırın. Kapağın hücre tarafını yerleştirin.

Bir parça parfüm üzerinde 25 mikrolitre dang humması e protein antikoru üzerine uyuyun. Işıktan korunan oda sıcaklığında nemli bir odada bir saat inkübe edin. Daha sonra, kapak fişini altı oyuklu bir plakaya aktarın ve yağ başına iki mililitre yıkama tamponu ekleyin.

Sırtı aspire edin. Son yıkamadan sonra bu yıkama adımlarını iki kez daha tekrarlayın. İnce fp kullanarak kapak kızağını kuyudan çıkarın.

Kapağın kenarını daldırarak fazla sıvıyı boşaltın. Bir kağıt mendilin üzerine kaydırın. Kapağın hücre tarafını yerleştirin.

Bir parça parfüm üzerinde sekiz sekiz anti fare ikincil antikoru için 25 mikrolitre Alexa zemininde uyuyun. İnkübasyon tamamlandıktan sonra ışıktan korunan oda sıcaklığında nemli bir odada 45 dakika inkübe edin, kapak uykusunu altı Kuyulu bir plakaya aktarın ve hücreleri iki mililitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın Son yıkamadan sonraki her yıkama için. Kapak fişini kuyudan çıkarın ve iyonize suda bir kez durulayın.

Bir kağıda batırarak fazla sıvıyı boşaltın. Kapak sürgüsünü sekiz mikrolitre hafif montaj solüsyonu ile bir mikroskop ışığına silerek monte edin. Montaj solüsyonunun gece havasını dört santigrat derece ayarlamasına izin verin.

Numune artık bir floresan veya konfokal mikroskop ile görüntülenmeye hazırdır. Kapak uykusunun yüzeyine küçük bir damla daldırma yağı damlatın ve mikroskobu sabitleyin. Mikroskop aşamasına kaydırın.

Mikroskop objektifi daldırma yağı ile temas edene kadar s'yi ayarlayın. Claral bir görüntü için, Zes Zen yazılımını kullanarak ortam ışıklarını kapatın. Numuneyi mikroskobun merceğinden doğrudan gözlemlemek için oküler musluğa tıklayın.

Hücrelerle bir dolgu bulun ve odağı ayarlayın. Şimdi satın alma moduna geçin. Çiçek düşmeleri arasındaki karışmayı en aza indirmek için Alexa kat 4 8 8 ve sonlu dört için ayrı parçalar seçin.

Sıralı uyarma ve algılama için boyalar ve set alımları. Görüntünün fazla veya az pozlanmadığından emin olmak için lazer güç kazancını ve ofseti ayarlayın. Görüntüyü yakalayın ve yerelleştirme işlevini kullanarak bir ilgi alanını analiz edin.

Örtüşme katsayısı, Alexa Flo Dye tarafından dang virüsünün etiketlenme derecesini tahmin etmek için kullanılabilir. Viral hücreler üzerinde basit bir immünofloresan testi yapıldı ve etiketleme derecesi, etiketli virüsün kolokalizasyonundan tahmin edilebilir: Anti e proteini ile, anti antikor boyama örtüşme katsayısı 0.65 ila 0.8 arasında değişir, bu da varyansların yaklaşık% 65 ila 80'inin Alexa zemin boyası ile etiketlendiğini düşündürür. Etiketleme prosedürünün başarılı olması için, etiketleme tamponunu hazırlamak ve etiketlemeden önce öfkeli taze çalışmaya başlamak ve Alexa zemin özetini yeniden oluşturmak önemlidir.

Kullanılacak boya konsantrasyonu, ihtiyaçlarınıza uyacak şekilde daha da optimize edilebilir. Horizon etiketleme dang virüsünün bu yöntemi, potansiyel olarak diğer virüsleri etiketlemek için uyarlanabilir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve etiketleme denemeniz için iyi şanslar.