Name: Alexa Fluor Etiketleme Dang Virüs görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Öğrenin, Alexa Fluor ile Dang virüsünü floresan etiketleme yöntemini. Bu teknik, virüs-hücre etkileşimlerini mikroskop altında görselleştirmeyi sağlar ve viral enfeksiyon mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Singapur Ulusal Tıp Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmiştir.

1. Dang virüsü Alexa Fluor etiketleme <ol><li> Etiketleme reaksiyon önce, sakaroz yastık dang virüs arındırmak ve protokolde belirtilen gerekli reaktifler ve ekipman hazırlamak. </li><li> Etiketleme ve filtre 0.2μm şırınga filtreler ile sterilize hemen önce taze 0,2 M sodyum bikarbonat tamponu, pH 8.5 (etiketleme tampon), ve 1,5 M hidroksilamin tamponu, pH 8.3 (reaktif durdurmak) hazırlayın. </li><li> 1ml 2ml tüp tampon etiketleme saflaştırılmış dang virüsü yaklaşık 3x10 8 plak oluşturan birim (pfu) sulandırınız. Bu virüs toplu etiketleme için orantılı büyütülüyor olabilir. </li><li> Sulandırın liyofilize Alexa Fluor 594 (AF594) hemen önce etiketleme reaksiyon tampon etiketleme 1mm succinimidyl esterleri. Alexa Fluor boya serisi Diğer fluorochromes ihtiyaçlarına göre kullanılıyor olabilir. Bu adım itibaren ışığa maruz kalma en aza indirin. </li><li> 1mm AF594 boya, 100μl seyreltilmiş virüs pipet ucu ile hafifçe karıştırarak ekleyin. </li><li> Karanlıkta 1hr için etiketleme reaksiyon karışımı oda sıcaklığında inkübe edin. Nazik inversiyon her 15mins karıştırın. </li><li> Bir masaüstü santrifüj tüp kısaca Spin ve pipet ucu ile hafifçe karıştırarak durdurmak reaktifin reaksiyon karışımı 100μl ekleyin. </li><li> Karanlık bir ek saat oda sıcaklığında inkübe edin. Nazik inversiyon her 15mins karıştırın. </li></ol> 2. Arındırıcı Alexa Fluor dang virüsü etiketli <ol><li> Bu arada, seçim tamponu ile arıtma sütun dengelenmesi. Bu deneyde, PD-10 sütun HNE tampon 25ml (5mM HEPES, 150mm NaCl, 0.1mm EDTA) Kullanmadan önce pH 7.4 ile dengelenmiş. </li><li> Sütunun üst etiketli virüs uygulayın ve etiketli virüs matris girer kez-through akış toplamaya başlar. Etiketli tüm virüs matris girdikten sonra HNE tamponu ile sütun doldurun. Flow-through ilk 2.5ml atın ve etiketli virüs fraksiyonu sonraki 2ml toplamak. </li><li> -80 Yılında saflaştırılmış AF594 etiketli Dang virüsü kısım ve mağaza ° C, ışık kaynağından uzakta. </li></ol><ol><li> Bir kısım çözülme ve etiketli virüs toplu kullanmadan önce virüs etiketli plak yöntemi ile titresi belirlemek. </li><li> Enfeksiyon bir gün önce iyice altındaki bir lamel ile 4 plaka M-199 büyüme ortamında yetişen Tohum Vero hücreleri 5x10 4'e göre,. </li><li> 37 iyi kültür süpernatantı ve 10dk 100μl hacmi (M-199 bakım orta gerektiği gibi seyreltilmiş) etiketli bir virüsün 1 enfeksiyon çokluğu ile hücreleri enfekte ° C </li><li> Inoculums çıkarın ve 1xPBS lamelleri iki kez yıkayın. </li><li> 30 dakika için% 3 paraformalydehyde hücrelerin sabitleyin. </li><li> 1xPBS lamelleri 3 kere yıkayın. </li><li> Permeabilization çözümü ile, 30 dakika için 1xPBS% 0,1 saponin ve% 5 BSA içeren hücreler Permeabilize. </li><li> Hücreleri inkübe sulandırılmamış santrifüj açıklık, nemli bir odasında 1hr 3H5 monoklonal antikor hibridoma kültür süpernatant ışıktan korunmalıdır. </li><li> (1xPBS 1mm kalsiyum klorür, 1mm magnezyum klorür ve% 0,1 saponin içeren) yıkama tamponu lamelleri 3 kere yıkayın. </li><li> AF488 anti-fare IgG ile hücreler inkübe, 1:100 nemli odasında 45 dakikaya, ışıktan koruyarak, permeabilization çözüm seyreltilmiş. </li><li> Lamelleri 3 kez yıkama tamponu deiyonize su ile yıkayın ve bir kez yıkayın. </li><li> Dab 8μl Mowiol 4-88 içeren% 2.5 Dabco aşırı su tahliye ve cam slayt üzerine monte etmek için bir kağıt havlu karşı lamel kenarında. </li><li> Zeiss konfokal mikroskop kullanarak görüntülemeden önce 4 geceleme ayarlamak için montaj çözümü ° C izin verin. Sıralı satın almalar, eş zamanlı dedektörleri arasında bir zaman ve anahtarlama heyecan verici bir fluorofor yapılmalıdır. </li><li> Görüntüler daha sonra etiketleme derecesini tahmin etmek Zeiss LSM Zen yazılımı kullanarak virüs etiketli E protein antikor boyama co-lokalizasyonu için analiz edilir. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar AF594 boya ile etiketlenmiş dang virüsü verim bir örnek Şekil 2'de gösterilmiştir. Normalde, ilk titresi 10 kat damla daha az başarılı etiketleme dikkat edilmelidir. Ancak, tüm tamponlar, başarılı olmak ve sulu çözeltileri 8 reaktif serbest asitleri hidroliz olarak Alexa Fluor succinimidyl esterleri sulandırıldıktan sonra hemen kullanılması gerekir etiketleme için taze hazırlıklı olmak olduğunu belirtmek gerekir . Sonra, etiketli virüs deneylerde kullanmadan önce yeterli floresan için kontrol edilmelidir. Vero hücreleri üzerinde basit bir immünofloresan tahlil yapıldı ve etiketleme derecesi etiketli virüsün anti-E protein antikor boyama ile co-lokalizasyon tahmin edilebilir. Kesmekal hücreleri incelendi ve tipik bir konfokal görüntü Şekil 3'te gösterilmiştir. Co-localisation virionlar yaklaşık 65 -% 80 boya ile etiketlenmiş olduğunu düşündüren, 0.65 ile 0.8 arasında değişen katsayılar örtüşme gösterdi LSM Zen yazılımı kullanarak görüntü analizi. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1.Overall düzeni dang virüs prosedürü Alexa Fluor boya etiketleme resmeden İlk olarak, ilgili tamponlar ve saflaştırılmış Dang virüsü hazırlanır. Alexa Fluor boya sulandırılmış ve tampon etiketleme seyreltilmiş dang virüse eklenir. Reaksiyon, daha sonra durdurmak reaktif ilavesi ile 1 saat sonra durdurulur. Ardından, ücretsiz boya etiketli virüs kaldırmak için bir boyut dışlama sütun aracılığıyla arındırılır. Son olarak, etiketli virüs plak yöntemi ile yeniden titre ve floresans test. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. AF594 etiketleme öncesi ve sonrası bir plaket tahlil belirlenen uygulanabilir virionlar (pfu / ml) sayısı ortalama AF594 etiketli dang virüsü bir kısım çözülmüş ve plak yöntemi ile yeniden titre ve genellikle 10 kat daha az açılan menüden gösterir. başlangıç ​​titresi. Hata çubukları çiftleri standart sapma gösterir. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Vero hücrelerinde dang virüs E proteinleri ile AF594 etiket Co-lokalizasyon gün önce lamelleri üzerinde yetiştirilen hücreler 37 ° 10 dakika için 1, İçişleri Bakanlığı AF594 etiketli Dang ile enfekte olmuş ° C Hücreler daha sonra sabit ve anti-D antikoru ile etiketlenmiş ve E protein ko (yeşil) ve AF594 etiketleme (kırmızı) açısından incelenir. Floresan sinyalleri 63X büyütme altında Zeiss LSM 710 konfokal mikroskop kullanılarak görüntülendi. Ölçek çubuğu 10μm. Içerlek gösterildiği gibi, Sarı, ko alanları işaret etmektedir.

<ol><li>Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &amp, Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fluorescent+Protein+Color+Palette%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Fluorescent Protein Color Palette.</a> Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li>
<li>Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+dengue+virus%3A+implications+for+flavivirus+organization%2C+maturation%2C+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion.</a> Cell. 108, 717-725 (2002).</li>
<li>Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethyl+sulfoxide+blocks+herpes+simplex+virus-1+productive+infection+in+vitro+acting+at+different+stages+with+positive+cooperativity.+Application+of+micro-array+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis.</a> BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).</li>
<li>Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+Alexa+Fluor+dye+labelling+of+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus.</a> J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Alexa+Fluor+Succinimidyl+Esters+%28Molecular+Probes%22">Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes</a>. , Invitrogen. (2009).</li>
<li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+proteins+stained+by+Alexa+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of proteins stained by Alexa dyes.</a> Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).</li>
<li>Freistadt, M. S., Eberle, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+poliovirus+for+flow+cytometric+cell+surface+binding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies.</a> J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).</li>
</ol>

Bu raporda AF594 boya kullanılmış olmasına rağmen, Alexa Fluor succinimidyl esterleri serisi fluorophores geniş bir yelpazede benzer etiketleme kimyası ile kullanılabilir. Bu etiketleme uygulaması görüntüleme ötesinde genişletmek olabilir. Flow sitometri, heyecanlı ve FACS makine ile tespit edilebilir fluorophores etiketleme derecesini tahmin etmek için konfokal mikroskopi bir alternatif olarak kullanılabilir. Alexa Fluor boyalar, serbest amino grupları, öncelikle arginin ve lizin...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Hidroksilamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 159417 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum hidroksit </td><td> Merck </td><td> 106498 </td><td></td></tr><tr><td> AF594 succinimidyl esterleri </td><td> Moleküler Problar, Invitrogen </td><td> A20004 </td><td></td></tr><tr><td> PD-10 sütun </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0851-01 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6147 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> M-199 </td><td> Invitrogen </td><td> 11150 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 4-plaka </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Lameller </td><td> Einst </td><td> 0111520 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop lamı </td><td> Marka Yelken </td><td> 7105 </td><td></td></tr><tr><td> 3H5 hibridoma </td><td> ATCC </td><td> HB46 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> 1. Tabanı </td><td> BUF-2040-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S4521 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Magnezyum klorür </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> Kalsiyum klorür </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3306 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 15,812-7 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D27802 </td><td></td></tr><tr><td> Masa üstü santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> 5424 </td><td></td></tr><tr><td> Konfokal mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> EKK 710 </td><td></td></tr></tbody></table> M-199 büyüme ortamı hazırlamak için, 500ml M-199, steril filtre olmayan amino asitlerin sodyum piruvat ve 5ml 5ml, FBS 50ml ekleyin. M-199 bakım ortamı hazırlamak için, FBS, 15ml, 500ml M-199, steril filtre olmayan amino asitlerin sodyum piruvat ve 5ml, 5ml ekleyin.

alexa fluor etiketleme dang virüs görselleştirme

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Virüs ve hücre arasındaki etkileşimin erken olaylar enfeksiyon sonucu üzerinde derin bir etkiye sahip olabilir. Bu etkileşimin etkileyen faktörlerin belirlenmesi, hastalık patogenezi daha iyi anlaşılması için yol ve böylece aşı veya tedavi edici tasarımı etkileyebilir. Bu nedenle, bu etkileşimin prob yöntemlerin geliştirilmesi yararlı olacaktır. Fluorophores geliştirme 1-3 ve görüntüleme teknolojisi 4, son gelişmeler, dang patogenezi ile ilgili mevcut bilgi geliştirmek ve böylece milyonlarca yılda meydana gelen dang enfeksiyonları azaltmak için önünü yararlanılabilir. Zarflı Dang virüsü tek bir pozitif iplikli RNA genomu 5 içeren nucleocapsid kabuk korunması, 90 zarf glikoprotein (E) dimerleri oluşan harici bir iskele vardır. Böylece virüsün yüzeyinde aynı protein altbirimden amin reaktif boya ile etiketlenmiş ve immunofluorescent mikroskobu yoluyla görüntülendi olabilir. Burada, Alexa Fluor succinimidyl ester boya etiketleme sonra, son derece canlı virüs vermiştir sodyum bikarbonat tampon doğrudan çözünmüş dang virüsü etiketleme basit bir yöntem mevcut. Canlı virüs ve protein etiketleme genellikle dimetil sülfoksit boya sulandırılması gereklidir mevcut üretici protokol etiketlenmesi için standart bir prosedür yoktur. Varlığı, dimetil sülfoksit dakika miktarlarda bile, virüs verimli enfeksiyonu engellemek ve aynı zamanda hücre sitotoksik 6 neden. Bu protokol dimetil sülfoksit kullanımı dışlama böylece bu olasılığı azalır. Alexa Fluor boyalar üstün fotostabilite ve hücresel alımı ve virüs endosomal taşıma çalışmaları için ideal hale getirir, floresein ve rodamin 2 olarak ortak boyalar, daha az pH duyarlı . Alexa Fluor boya konjugasyon virüs spesifik antikor ve konak hücrelerine 7 varsayılan reseptörleri etiketli Dang virüsü tanıma etkilemedi. Bu yöntem, virolojik çalışmalarda faydalı uygulamalar olabilir.

Fluorofor geliştirme ve görüntüleme teknolojisi, virüs, virüs ve hücre arasındaki ilk etkileşimleri görselleştirmek için geliştirildi dang Alexa Fluor etiketleme basit bir yöntem gelişmeler yararlanan.

Alexa Fluor Etiketleme Dang Virüs görselleştirme

Virüs ve hücre arasındaki etkileşimin erken evreleri, enfeksiyonun sonucu üzerinde derin bir etkiye sahip olabilir. ... faktörlerin belirlenmesi

Bu deneyin genel amacı, mikroskobik çalışmalar için dengue virüsünü floresanla işaretlemektir. Gerekli tamponları hazırlayın ve sükroz yastığı ile dengue virüsünü saflaştırın; ardından Amy React Alexa flow boyasını ve dengue virüsünü işaretleme tamponu içerisinde yeniden süspande edin. Dengue virüsünü 100 µM Alexa flow ile işaretleyin.Bir saat boyunca bekletin ve etiketleme reaksiyonunu uygun reaktifle durdurun. Etiketli dengue virüsünü bir boyut dışlama kolonu aracılığıyla saflaştırın. Etiketli virüsü plak sayımı ile yeniden titre edin ve etiketleme derecesini immünofloresan testi ile tahmin edin.Merhaba, ben NUS mezun tıp okulundan sonra, gelişmekte olan bulaşıcı hastalıklar programındaki Dr. Wee'nin laboratuvarında çalışan DSO Ulusal Laboratuvarları'ndan Sam Jang. Bugün size, görüntüleme çalışmaları için Dengue virüsünün Amy Reaktif Alexa floresan boyası ile nasıl floresan olarak işaretleneceğini göstereceğim. Alexa floresan boyaları, stabilite açısından üstündür ve flüoresein ile rhodamine gibi yaygın boyalara göre pH'a karşı daha az duyarlıdır; bu da onları virüsün hücresel alımı ve endozomal taşınımı üzerine yapılan çalışmalar için ideal kılar.Alexa floruyla işaretlenmiş dengue virüsü, dengue patogenezinin anlaşılmasını kolaylaştıracaktır. Öyleyse başlayalım. İşaretleme reaksiyonundan önce, yazılı protokole uygun olarak taze işaretleme tamponu ve durdurma reaktifini hazırlayın ve dengue virüsünü sükroz yastığı ile saflaştırın; ardından, mililitre başına 300 milyon formülasyon birimi konsantrasyonuna ulaşmak için saflaştırılmış dengue virüsünün uygun hacmini bir mikrosantrifüj tüpündeki işaretleme tamponuna ekleyin.Bu miktar orantılı olarak artırılabilir. Virüslerin toplu etiketlenmesi için; liyofilize Alexa flor boyayı, etiketleme reaksiyonundan hemen önce etiketleme tamponu ile bir milimolar konsantrasyonda yeniden çözünür hale getirin.Bu adımdan itibaren ışığa maruz kalımı en aza indirin. Gösterim amacıyla, Alexa akış boyası ışığa karşı korunmayacaktır. Mikropipet ucuyla nazikçe karıştırırken, seyreltilmiş dengue virüsüne 1 mM'lik Alexa akış boyasından 800 µL ekleyin.Işık koruması altında, her 15 dakikada bir hafifçe ters çevirerek karıştırarak oda sıcaklığında bir saat inkübe edin; bir saatin sonunda tüpleri kısa süreliğine santrifüjleyin. Mikropipet ile hafifçe karıştırarak alt bölgeden 800 µL alın; ışık koruması altında, her 15 dakikada bir hafifçe ters çevirerek karıştırarak oda sıcaklığında bir saat daha inkübe edin.Bu sırada, saflaştırma kolonunu 25 mililitre HNE tamponu ile dengeleyin. Bir saatlik inkübasyonun ardından, etiketlenmiş virüsü kolona uygulayın ve geçiş sıvısını toplamaya başlayın. Kolonu HNE tamponu ile doldurun.İşaretlenmiş virüsün tamamı matrise girdikten sonra, akıştan geçen ilk 2,5 mililitreyi atın ve işaretlenmiş virüs fraksiyonunun sonraki iki mililitresini toplayın. Saflaştırılmış işaretlenmiş virüsü -80 °C'de dondurarak saklayın. İşaretlenmiş virüsün titresi plak analizi ile belirleyin.Tipik bir deneyde, virüs titresinde on kattan daha az bir düşüş gözlemlenmelidir. Etiketleme sonrası, etiketleme derecesini değerlendirmek için bir immünofloresan analiz uygulanmalıdır. Bunun için, bir hemositometre kullanarak viral hücreleri sayın ve mililitre başına 50.000 hücre yoğunluğu elde etmek için büyüme ortamına uygun hacimde hücre ekleyin.Steril cam kapak içeren dört kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa bir mililitre viral hücre ekleyin. Hücreleri 37 °C'de %5 karbondioksit ile gece boyunca inkübe edin. Plağı inkübatörden çıkarın ve kuyucuklardaki süpernatantı aspire edin; ardından hücreleri, 100 µL hacimdeki yaklaşık bir MOI etiketli virüs ile 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.İnokülumu uzaklaştırın ve hücreleri kuyu başına 0,5 mililitre PBS tamponu ile yıkayın. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın. Hücreleri, kuyu başına 200 mikrolitre %3'lük paraformaldehit ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca fikse edin.Hücreleri, kuyu başına 0.5 milliliters PBS tamponu ile üç kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 30 Minutes boyunca fiksasyon çözeltisi ile sabitleyin. Kuyu üzerindeki örtü camını ince uçlu pens kullanarak çıkarın.Lam camının kenarından emdirerek fazla sıvıyı uzaklaştırın. Kağıt havlu yardımıyla kaydırın. Lam camının hücre tarafını yerleştirin.Bir parça parafilm üzerine 25 µL dengue e protein antikoru damlatın. Işıktan korunmuş şekilde, oda sıcaklığında, nemli bir bölmede bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, lamelini altı kuyucuklu bir plakaya aktarın ve her kuyucuğa iki mL yıkama tamponu ekleyin.Süpernatantı aspire edin. Bu yıkama adımlarını son yıkamadan sonra iki kez daha tekrarlayın. Lamine camı, ince uçlu pensle kuyucuktan çıkarın.Kapak kenarını batırarak fazla sıvıyı süzün. Kağıt mendil üzerinde kaydırın. Kapağın hücre tarafını yerleştirin.Bir parça parafilm üzerine 25 µL Alexa Fluor 488 anti-fare sekonder antikor koyun. Işıktan koruyarak, oda sıcaklığında, nemli bir bölmede 45 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, lam üzerindeki örtü camını altı kuyucuklu bir plakaya aktarın ve hücreleri her yıkama için 2 mL yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, örtü camını kuyucuktan çıkarın ve iyonize su ile bir kez durulayın.Fazla sıvıyı bir kağıda değdirerek süzün. Kapatma camını, sekiz mikrolitre hafif sabitleme solüsyonu kullanarak bir mikroskop lamı üzerine monte edin. Sabitleme solüsyonunun dört derece santigrat sıcaklıkta, gece boyunca havada donmasını bekleyin.Numune artık floresan veya konfokal mikroskop ile görüntülenmeye hazırdır. Lamın üzerine küçük bir damla imersiyon yağı damlatın ve lamı mikroskop tablasına sabitleyin.Mikroskop objektifi immersiyon yağıyla temas edene kadar sahneyi ayarlayın. Net bir görüntü için, Zes Zen yazılımını kullanarak ortam ışıklarını kapatın. Numuneyi mikroskobun okülerinden doğrudan gözlemlemek için oküler sekmesine tıklayın.Hücre içeren bir alan bulun ve odağı ayarlayın. Şimdi görüntüleme moduna geçin. Florokromlar arasındaki çapraz etkileşimi en aza indirmek için Alexa Fluor 488 ve Cy5 için ayrı kanallar seçin.Boyalar ve setler, sıralı uyarım ve deteksiyona göre ayarlanır. Görüntünün aşırı pozlanmadığından veya düşük pozlandığından emin olmak için lazer gücü kazancını ve ofsetini ayarlayın. Görüntüyü yakalayın ve kolokalizasyon fonksiyonunu kullanarak ilgi alanını analiz edin.Örtüşme katsayısı, dengue virüsünün Alexa Flo Boyası ile etiketlenme derecesini tahmin etmek için kullanılabilir. Viral hücreler üzerinde basit bir immünofloresans analizi yapılmış ve etiketlenme derecesi, etiketli virüs ile anti-e proteini, anti-antikor boyaması arasındaki kolokalizasyondan tahmin edilebilmiştir; örtüşme katsayısının 0,65 ile 0,8 arasında olması, varyansların yaklaşık %65 ila %80'inin Alexa Flo boyası ile etiketlendiğini göstermektedir. Etiketleme prosedürünün başarılı olması için, etiketleme tamponunun hazırlanması, taze reaktiflerin kullanılması ve etiketleme öncesinde Alexa Flo boyasının yeniden çözündürülmesi önemlidir.Kullanılacak boya konsantrasyonu, ihtiyaçlarınıza göre daha da optimize edilebilir. Dengue virüsünün horizon etiketleme yöntemi, potansiyel olarak diğer virüsleri etiketlemek için de uyarlanabilir. İşte hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür eder, etiketleme deneyinizde başarılar dileriz.

visualizing-dengue-virus-through-alexa-fluor-labeling

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Fonksiyon-Spacer-Lipid (FSL) yapıları canlılık kaybı olmadan, canlı hücreler ve virionlar yüzey özelliklerinin değiştirilmesine izin verir. Bu yöntem, sadece basit bir hücre / virion ve spontan ve kararlı bir yüzey dahil oluşur FSL inşa çözüm temas gerektirir.

FSL oluşturur: immunoseparasyon bir Aralığı Hücre / virion Yüzeyleri değiştirmek için Basit Bir Yöntem, Canlılık Etkileyen olmadan

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Adenovirüs parçacıklar doğal olmayan bir amino asit analog azidohomoalanine veya azido şeker içermesi için...

Bioorthogonal tıklayın Kimya ile Viral Yüzeylerin Kemoselektif Modifikasyonu

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

Kaynak: Zaeck, L.,  et al. Solventten Arındırılmış Beyin Dokusunda Kuduz Virüsü Enfeksiyonunun Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2019).  Bu video, enfeksiyon ilerlemesini değerlendirmek için kuduz virüsü (RABV) ile enfekte olmuş fare beyin dokusunun hazırlanması ve görüntülenmesi sürecini göstermektedir. Floresan işaretleyicilerle doku boyama, dehidrasyon, temizleme ve konfokal lazer tarama mikroskobu için montaj dahil olmak üzere üç boyutlu bir temsilin oluşturulmasıyla...

Fare Beyin Dokusunda Kuduz Virüsü Enfeksiyonunun Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Virionların yüzeye bağlanması, Süper çözünürlüklü floresan görüntüleme veya atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile tek virion görüntüleme için bir gerekliliktir. Burada, VIRIONların AFM ve süper çözünürlüklü floresan görüntülemede kullanıma uygun cam yüzeylere kontrollü yapışıklık için örnek bir hazırlama yöntemi gösteriyoruz.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Virüsler veya hücre dışı veziküller, yüzey antijenlerini tanıyan antikorlara bağlı 15 nm manyetik nanopartiküller ile immüno-yakalandı. Yakalanan virionlar veya veziküller, diğer yüzey antijenlerine karşı floresan antikorlarla etiketlendi. Elde edilen kompleksler yüksek manyetik alanda ayrıldı ve floresan üzerinde tetiklenen geleneksel akış sitometreleri ile analiz edildi.

Virionlar antijenik Spectra ve ekstrasellüler veziküllerin Analiz Virometry Akış

Burada RNA Mango aptamers ı, II, III veya IV ile etiketlenmiş görüntü Rnas 'ında doğal veya denatüre Poliakrilamid jel elektroforezi (Page) jelleri kullanarak hassas, hızlı ve ayrımcılık sonrası jel boyama yöntemi sunuyoruz. Standart sayfa jeller çalıştırdıktan sonra, Mango-Tagged RNA kolayca TO1-biotin ile lekelenmiş ve daha sonra yaygın olarak kullanılabilir floresan okuyucular kullanılarak analiz edilebilir.

Polyacrylamide jeller içinde Mango-Tagged RNA floresan görselleştirme bir Poststaining yöntemi ile

Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Burada, şiddetli akut solunum sendromu coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA'yı görselleştirmek için RNA floresan in situ hibridizasyonunu (RNA-FISH) immünofluoresans ile birleştiren basit bir yöntemi açıklıyoruz. Bu protokol, SARS-CoV-2 RNA konakçı etkileşimlerinin moleküler özelliklerinin tek hücre düzeyinde anlaşılmasını artırabilir.

Immuno RNA-Floresan In Situ Hibridizasyonu Kullanılarak SARS-CoV-2'nin Görselleştirilmesi

Burada açıklanan protokol, sars-CoV-2 spike proteinine karşı nötralize edici antikorları ölçmek için hızlı ve etkili bir yöntemi özetlemektedir, iyileşen serum örneklerinin gelişmiş yeşil floresan protein etiketli veziküler stomatit virüsü psödotip ile enfeksiyonu inhibe etme yeteneğini değerlendirerek spike glikoprotein ile.

Psödovirüs Enfeksiyonunun Yüksek Verimli Floresan Görüntülemesi Kullanılarak SARS-CoV-2 Nötralize Edici Antikorların Tespiti

Öğrenin, Alexa Fluor ile Dang virüsünü floresan etiketleme yöntemini. Bu teknik, virüs-hücre etkileşimlerini mikroskop altında görselleştirmeyi sağlar ve viral enfeksiyon mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Alexa Fluor Etiketleme Dang Virüs görselleştirme

Daha fazla video keşfet