Alexa Fluor Etiketleme Dang Virüs görselleştirme

Bu deneyin genel amacı, mikroskobik çalışmalar için dengue virüsünü floresanla işaretlemektir. Gerekli tamponları hazırlayın ve sükroz yastığı ile dengue virüsünü saflaştırın; ardından Amy React Alexa flow boyasını ve dengue virüsünü işaretleme tamponu içerisinde yeniden süspande edin. Dengue virüsünü 100 µM Alexa flow ile işaretleyin.

Bir saat boyunca bekletin ve etiketleme reaksiyonunu uygun reaktifle durdurun. Etiketli dengue virüsünü bir boyut dışlama kolonu aracılığıyla saflaştırın. Etiketli virüsü plak sayımı ile yeniden titre edin ve etiketleme derecesini immünofloresan testi ile tahmin edin.

Merhaba, ben NUS mezun tıp okulundan sonra, gelişmekte olan bulaşıcı hastalıklar programındaki Dr. Wee'nin laboratuvarında çalışan DSO Ulusal Laboratuvarları'ndan Sam Jang. Bugün size, görüntüleme çalışmaları için Dengue virüsünün Amy Reaktif Alexa floresan boyası ile nasıl floresan olarak işaretleneceğini göstereceğim. Alexa floresan boyaları, stabilite açısından üstündür ve flüoresein ile rhodamine gibi yaygın boyalara göre pH'a karşı daha az duyarlıdır; bu da onları virüsün hücresel alımı ve endozomal taşınımı üzerine yapılan çalışmalar için ideal kılar.

Alexa floruyla işaretlenmiş dengue virüsü, dengue patogenezinin anlaşılmasını kolaylaştıracaktır. Öyleyse başlayalım. İşaretleme reaksiyonundan önce, yazılı protokole uygun olarak taze işaretleme tamponu ve durdurma reaktifini hazırlayın ve dengue virüsünü sükroz yastığı ile saflaştırın; ardından, mililitre başına 300 milyon formülasyon birimi konsantrasyonuna ulaşmak için saflaştırılmış dengue virüsünün uygun hacmini bir mikrosantrifüj tüpündeki işaretleme tamponuna ekleyin.

Bu miktar orantılı olarak artırılabilir. Virüslerin toplu etiketlenmesi için; liyofilize Alexa flor boyayı, etiketleme reaksiyonundan hemen önce etiketleme tamponu ile bir milimolar konsantrasyonda yeniden çözünür hale getirin.

Bu adımdan itibaren ışığa maruz kalımı en aza indirin. Gösterim amacıyla, Alexa akış boyası ışığa karşı korunmayacaktır. Mikropipet ucuyla nazikçe karıştırırken, seyreltilmiş dengue virüsüne 1 mM'lik Alexa akış boyasından 800 µL ekleyin.

Işık koruması altında, her 15 dakikada bir hafifçe ters çevirerek karıştırarak oda sıcaklığında bir saat inkübe edin; bir saatin sonunda tüpleri kısa süreliğine santrifüjleyin. Mikropipet ile hafifçe karıştırarak alt bölgeden 800 µL alın; ışık koruması altında, her 15 dakikada bir hafifçe ters çevirerek karıştırarak oda sıcaklığında bir saat daha inkübe edin.

Bu sırada, saflaştırma kolonunu 25 mililitre HNE tamponu ile dengeleyin. Bir saatlik inkübasyonun ardından, etiketlenmiş virüsü kolona uygulayın ve geçiş sıvısını toplamaya başlayın. Kolonu HNE tamponu ile doldurun.

İşaretlenmiş virüsün tamamı matrise girdikten sonra, akıştan geçen ilk 2,5 mililitreyi atın ve işaretlenmiş virüs fraksiyonunun sonraki iki mililitresini toplayın. Saflaştırılmış işaretlenmiş virüsü -80 °C'de dondurarak saklayın. İşaretlenmiş virüsün titresi plak analizi ile belirleyin.

Tipik bir deneyde, virüs titresinde on kattan daha az bir düşüş gözlemlenmelidir. Etiketleme sonrası, etiketleme derecesini değerlendirmek için bir immünofloresan analiz uygulanmalıdır. Bunun için, bir hemositometre kullanarak viral hücreleri sayın ve mililitre başına 50.000 hücre yoğunluğu elde etmek için büyüme ortamına uygun hacimde hücre ekleyin.

Steril cam kapak içeren dört kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa bir mililitre viral hücre ekleyin. Hücreleri 37 °C'de %5 karbondioksit ile gece boyunca inkübe edin. Plağı inkübatörden çıkarın ve kuyucuklardaki süpernatantı aspire edin; ardından hücreleri, 100 µL hacimdeki yaklaşık bir MOI etiketli virüs ile 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.

İnokülumu uzaklaştırın ve hücreleri kuyu başına 0,5 mililitre PBS tamponu ile yıkayın. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın. Hücreleri, kuyu başına 200 mikrolitre %3'lük paraformaldehit ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca fikse edin.

Hücreleri, kuyu başına 0.5 milliliters PBS tamponu ile üç kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 30 Minutes boyunca fiksasyon çözeltisi ile sabitleyin. Kuyu üzerindeki örtü camını ince uçlu pens kullanarak çıkarın.

Lam camının kenarından emdirerek fazla sıvıyı uzaklaştırın. Kağıt havlu yardımıyla kaydırın. Lam camının hücre tarafını yerleştirin.

Bir parça parafilm üzerine 25 µL dengue e protein antikoru damlatın. Işıktan korunmuş şekilde, oda sıcaklığında, nemli bir bölmede bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, lamelini altı kuyucuklu bir plakaya aktarın ve her kuyucuğa iki mL yıkama tamponu ekleyin.

Süpernatantı aspire edin. Bu yıkama adımlarını son yıkamadan sonra iki kez daha tekrarlayın. Lamine camı, ince uçlu pensle kuyucuktan çıkarın.

Kapak kenarını batırarak fazla sıvıyı süzün. Kağıt mendil üzerinde kaydırın. Kapağın hücre tarafını yerleştirin.

Bir parça parafilm üzerine 25 µL Alexa Fluor 488 anti-fare sekonder antikor koyun. Işıktan koruyarak, oda sıcaklığında, nemli bir bölmede 45 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, lam üzerindeki örtü camını altı kuyucuklu bir plakaya aktarın ve hücreleri her yıkama için 2 mL yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, örtü camını kuyucuktan çıkarın ve iyonize su ile bir kez durulayın.

Fazla sıvıyı bir kağıda değdirerek süzün. Kapatma camını, sekiz mikrolitre hafif sabitleme solüsyonu kullanarak bir mikroskop lamı üzerine monte edin. Sabitleme solüsyonunun dört derece santigrat sıcaklıkta, gece boyunca havada donmasını bekleyin.

Numune artık floresan veya konfokal mikroskop ile görüntülenmeye hazırdır. Lamın üzerine küçük bir damla imersiyon yağı damlatın ve lamı mikroskop tablasına sabitleyin.

Mikroskop objektifi immersiyon yağıyla temas edene kadar sahneyi ayarlayın. Net bir görüntü için, Zes Zen yazılımını kullanarak ortam ışıklarını kapatın. Numuneyi mikroskobun okülerinden doğrudan gözlemlemek için oküler sekmesine tıklayın.

Hücre içeren bir alan bulun ve odağı ayarlayın. Şimdi görüntüleme moduna geçin. Florokromlar arasındaki çapraz etkileşimi en aza indirmek için Alexa Fluor 488 ve Cy5 için ayrı kanallar seçin.

Boyalar ve setler, sıralı uyarım ve deteksiyona göre ayarlanır. Görüntünün aşırı pozlanmadığından veya düşük pozlandığından emin olmak için lazer gücü kazancını ve ofsetini ayarlayın. Görüntüyü yakalayın ve kolokalizasyon fonksiyonunu kullanarak ilgi alanını analiz edin.

Örtüşme katsayısı, dengue virüsünün Alexa Flo Boyası ile etiketlenme derecesini tahmin etmek için kullanılabilir. Viral hücreler üzerinde basit bir immünofloresans analizi yapılmış ve etiketlenme derecesi, etiketli virüs ile anti-e proteini, anti-antikor boyaması arasındaki kolokalizasyondan tahmin edilebilmiştir; örtüşme katsayısının 0,65 ile 0,8 arasında olması, varyansların yaklaşık %65 ila %80'inin Alexa Flo boyası ile etiketlendiğini göstermektedir. Etiketleme prosedürünün başarılı olması için, etiketleme tamponunun hazırlanması, taze reaktiflerin kullanılması ve etiketleme öncesinde Alexa Flo boyasının yeniden çözündürülmesi önemlidir.

Kullanılacak boya konsantrasyonu, ihtiyaçlarınıza göre daha da optimize edilebilir. Dengue virüsünün horizon etiketleme yöntemi, potansiyel olarak diğer virüsleri etiketlemek için de uyarlanabilir. İşte hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, etiketleme deneyinizde başarılar dileriz.