DNA Metilasyonu: bisülfit modifikasyonu ve Analiz

Bu prosedürün genel amacı, sülfit ile dönüştürülmüş DNA'nın genomik dizilemesi yoluyla CpG dinükleotidlerinin DNA metilasyon analizini gerçekleştirmektir. Bu, öncelikle çift zincirli DNA'nın denatüre edilmesiyle sağlanır, böylece bisülfit dönüştürme reaksiyonu gerçekleşebilir. İkinci adım, genomik DNA'daki tüm metillenmemiş sitozinlerin bisülfit deaminasyonu ile urasile dönüştürülmesidir.

Bu reaksiyon üç aşamadan oluşur. İlk aşama, B sülfitin beş altı çift bağına eklenmesiyle sitozin kalıntısının sülfatlanmasıdır. İkinci olarak, sülfit türevi aracılığıyla sitozinin hidrolitik deaminasyonu bir SSL sülfit türevi üretir ve üçüncü olarak, alkali işlemle sülfonat grubunun uzaklaştırılması bir SSL kalıntısı ile sonuçlanır.

Ardından, hedef bölge bisülfit dönüşümüne özgü primerler ve PCR amplifikasyonu ile çoğaltılır. Son adım, DNA molekülü boyunca metilasyon için tek nükleotid çözünürlüğü sağlamak amacıyla PCR ürününün klonlanması ve dizilenmesidir. Nihayetinde sonuçlar, asidik koşullar altında sitozinin beş metil sitozine kıyasla bisülfat deaminasyonuna karşı artan hassasiyetinden yararlanarak genomik DNA'daki CPG dinükleotidlerinin DNA metilasyonunu göstermektedir.

Bu tekniğin Southern kan analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, DNA metilasyonunun tek nükleotid çözünürlüğünde analizine olanak tanımasıdır. Bu yöntem, kanser gibi insan hastalıklarında DNA metilasyonunun rolü gibi epigenetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. DNA örneklerini bisülfit dönüşümüne hazırlamak için, öncelikle iki mikrogram genomik DNA'yı bisülfit, DNA lizis tamponu ile birlikte toplam 18 mikrolitre hacminde 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

Ardından, genomik DNA'yı, son konsantrasyon 0,3 M olacak şekilde iki µL taze hazırlanmış 3 M sodyum hidroksit ekleyerek denatüre edin. Numuneleri bir su banyosunda 15 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin ve ardından iki dakika boyunca 90 °C'de inkübe edin. Bir ısı bloğunda, tüpleri hemen beş dakika boyunca buza yerleştirin, DNA'nın tüpün dibinde olduğundan emin olmak için tüpleri 10 saniye boyunca 10.000 G'de santrifüjleyin; denatüre DNA numuneleri artık bir sonraki aşamada gösterilecek olan B hücresiyle ilişkilendirilmiş deaminasyon işlemi için hazırdır.

Sülfasyon ve hidrolitik deaminasyon reaksiyonlarından önce, 10 millimolar kinol ve pH 5.0'da doygun sodyum metabisülfit taze çözeltilerini hazırlayın. Sodyum metabisülfit doygun bir çözelti olduğu için küçük topakların çözünmeden kalabileceği göz önünde bulundurulmalıdır. 20 microliter denatüre DNA'ya, final hacmi 240 microliters olacak şekilde 208 microliters sodyum metabisülfit ve 12 microliters kinol ekleyin.

Tüm damlacıkların tüpün dibine çöktüğünden emin olmak için tüpleri vorteksleyin ve 10 saniye boyunca santrifüjleyin. Numunelerin üzerini mineral yağ ile kaplayın. Dönüştürülecek DNA'nın miktarına ve kalitesine bağlı olarak numuneleri bir su banyosunda 55 °C'de dört ila 16 saat inkübe edin.

Oksidasyonu önlemek için bisülfit dönüşümünün karanlıkta gerçekleşmesi önemlidir. Uygun inkübasyon süresinin sonunda, tüm sıvının tüpün dibinde olduğundan emin olmak için tüpleri bir mikrosantrifüjde kısa süreliğine santrifüjleyin. Ardından, mineral yağından hiçbir miktar almadan DNA çözeltisini tüpün dibinden dikkatlice pipetle çekin.

Sonraki adımlar için laboratuvarımız Promega Wizard DNA temizleme sistemini kullanmaktadır. DNA örneklerine bir mililitre reçine ekleyin, karıştırmak için tüpü ters çevirin, ardından çözeltiyi tuz giderme kolonuna bağlı bir şırıngaya pipetleyin. Son olarak, serbest bisülfit iyonlarını uzaklaştırmak için bisülfitle işlenmiş DNA'yı tuz giderme kolonundan geçirin ve 50 µL Milli Q su ile elüye edin.

Sıradaki adım, tuzsuzlaştırma yoluyla urasil halkasındaki bisülfit adüktünü uzaklaştırmaktır. Bunu gerçekleştirmek için, her bir bisülfitle işlem görmüş DNA örneğine 0.3 molar final konsantrasyon sağlayacak şekilde 5.5 µL taze hazırlanmış üç molar sodyum hidroksit ekleyin. Ardından örnekleri 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.

Numuneleri kısa süreliğine santrifüjleyin ve ardından her numuneye bir mikrolitre TRNA ekleyin. Amonyum asetatı son konsantrasyonu üç molar olacak şekilde ekleyerek çözeltiyi nötralize edin. Daha sonra DNA'yı etanolle çöktürün.

Buz soğukluğunda, %100 etanolden 330 µL ekleyin ve ters çevirerek iyice karıştırın. Bir saat boyunca veya gece boyunca -20 °C'de bekletin, ardından 4 °C'de 15 dakika boyunca 14,000 ×g'de santrifüjleyin. Daha sonra süpernatantın tüm kalıntılarını uzaklaştırın ve çöken DNA'yı yaklaşık 20 dakika boyunca havada kurutun.

Hava ile kurutulduktan sonra peletin görülmesi neredeyse imkansızdır; DNA peletini 50 µL 0.1 XTE veya su içerisinde yeniden süspande edin ve yaklaşık iki saat boyunca oda sıcaklığında bekletin. Bu süre zarfında, DNA'nın tamamen çözündüğünden emin olmak için tüpleri ara ara vortekslen ve ardından hızlıca santrifüjleyin. DNA çözündükten sonra, DNA'nın miktarına ve kalitesine bağlı olarak -20 °C'de bir ile 10 yıl arasında saklanabilir veya hemen kullanılabilir. PCR amplifikasyonu için primer optimizasyonu, bu prosedürün en zor kısmıdır.

Bu nedenle, primer tasarımının başarılı olmasını sağlamaya yardımcı olmak amacıyla aşağıdaki kılavuzlar sunulmuştur. Bu kılavuzları örneklendirmek için hedef dizilime sülfit dönüşümü uygulanmıştır; böylece yazıldığında, dönüşmüş sitozinler mavi T'ler ve dönüşmemiş CpG bölgeleri kırmızı cg'ler olarak görünmektedir. Özgünlüğü sağlamak için primerlerin uzunluğu 24 ila 30 baz çifti olmalıdır. Primerlerin tahmini Tm değerleri 50 °C'nin üzerinde ve birbirine benzer olmalı, aradaki fark bir ila iki °C'yi geçmemelidir.

Dönüşüm özgüllüğünü sağlamak için primerler, yaklaşık %25 oranında C'den T'ye bazlar içermelidir. Üç primer ucundaki son baz, dönüştürülmüş D-N-A-C-P-G dinükleotidlerinin amplifikasyonunu sağlamak için C'den T'ye olmalıdır; metillenmiş, metillenmemiş veya dönüştürülmemiş şablonlara karşı potansiyel yanlılığı önlemek için primer dizisinde CPG dinükleotidlerinden kaçınılmalıdır. Ancak, kaçınılmaz olduğu durumlarda, dönüştürülmüş DNA'nın tarafsız amplifikasyonunu sağlamaya yardımcı olmak için CPG bölgesindeki sitozin bir Y ile değiştirilmelidir.

Son olarak, gerekliyse PCR reaksiyonunun özgüllüğünü veya hassasiyetini sağlamak için iç içe (nested) veya yarı iç içe (semi-nested) primer setleri tasarlayın. Optimizasyon için PCR amplifikasyon reaksiyon karışımlarını 25 µL'lik alikotlar halinde hazırlayın. Metillenmiş veya metillenmemiş materyalin amplifikasyon eğilimini test etmek için her reaksiyon; sülfit ile dönüştürülmüş genomik DNA, DPS primerleri, magnezyum klorür, potasyum klorür, tris hidroklorür pH 8.3 ve anac polimeraz içerir.

Bisülfit dönüşümü ile orantılı PCR amplifikasyonunu test etmek için %50 metillenmiş ve metillenmemiş, tamamen bisülfit dönüşümü uygulanmış bir kontrol örneği kullanın. Spesifik primerler ve PCR reaksiyon karışımı ile sıcaklık gradyanlı bir termosaykler cihazında, reaksiyonu primerin TM değerinin artı veya eksi üç °C gradyanında 8 ila 10 tüpe yayarak çalıştırın; tüpleri vortekslen ve termosayklere yerleştirmeden önce bir mikro santrifüjde kısa süreli olarak döndürün. Bu şekil, %50 metillenmiş ve metillenmemiş DNA karışımından elde edilen sıcaklık gradyanlı PCR amplifikasyon profilini içeren bir agaroz jeli göstermektedir.

PCR amplikonları ve T olarak işaretlenen iki, beş ve sekiz numaralı şeritler, yalnızca metillenmiş DNA'yı sindirecek bir restriksiyon enzimi ile işlenmiştir; optimal PCR amplifikasyon koşulları, metillenmiş ve metillenmemiş amplikonları orantılı ve tarafsız bir şekilde amplifiye etmeli ve burada görüldüğü gibi eşit miktarda kesilmiş ve kesilmemiş PCR ürünü ile sonuçlanmalıdır. Tarafsız amplifikasyon için optimal termodöngü koşulları 55.6 °C'dir. Bisülfit DNA'nın tam dönüşümü, yalnızca dönüşmemiş DNA'yı sindirecek sitozin bölgeye özgü bir enzim ile sindirim yapılarak analiz edilebilir; bunlar üç, altı ve dokuz numaralı şeritlerdir.

Tam bisülfit DNA dönüşümü, burada üç şeridin tamamında (üçüncü, altıncı ve dokuzuncu şeritler) kesilmiş DNA'nın bulunmamasıyla gösterilmiştir. Bu gerçek zamanlı disosiyasyon grafiği, tam metilleşmiş (pembe çizgi m) ve metillenmemiş (yeşil çizgi U) DNA kontrol amplifikasyonlarına kıyasla, metilleşmiş ve metillenmemiş DNA'nın eşit oranlarda olduğunu (kırmızı-turuncu çizgi 50/50 karışım) göstermektedir; bunlar sırasıyla 82,9 °C ve 86,9 °C'de disosiyasyona uğrar. Bu durum, farklı moleküllerin disosiyasyona uğrayacağı sıcaklığa bağlı olarak herhangi bir amplifikasyon yanlılığı olmadığını göstermektedir.

Bisülfit ile işlem görmüş örneklerin amplifikasyonundan elde edilen PCR fragmanları, agaroz jel elektroforezi ile görselleştirilebilir ve dizilenebilir. Burada, CpG bölgelerinin sarı ile vurgulandığı üç farklı hücre hattına ait bir dizi izi doğrudan gösterilmektedir; hücre hattı X, üç CpG bölgesinin tamamında %100 metilasyon sergilerken, hücre hatları Y ve Z, burada gösterilen örtüşen GA sinyallerinden anlaşıldığı üzere farklı derecelerde metilasyon göstermektedir. Şekil 4A, CpG bölgelerinin sarı ile vurgulandığı üç farklı hücre hattına ait bir dizi izidir.

Tek tek klonların doğrudan sekanslanmasının ardından, bireysel moleküllerin metilasyon durumu bir bisülfit haritasında tablolanabilir. Metilasyon heterojenliğini görselleştirmek için, bireysel CpG bölgelerindeki metilasyon yoğunluğu kırmızı ile gösterilmiştir. Bu temsilci bisülfit haritasında, bir örneğin yüksek verimli kantitatif metilasyon analizi sunulmaktadır.

Sequenome epi typer teknolojisinin kullanımı, Şekil 5 A'da gösterildiği gibi, metillenebilir sitozinlerin varlığına bağlı olarak spesifik bir spektrum oluşturabilir. Ardından, örnekteki oranların özeti bir epigram şeklinde ekstrapole edilebilir (Şekil 5 B). Bu örnek, dört farklı hücre hattı için her bir CpG bölgesindeki DNA metilasyon yüzdesini göstermektedir. Son olarak, epigram geliştirildikten sonra bir metilasyon grafiği özeti (Şekil 5 C) elde edilebilir. Bu teknik, epigenetik alanındaki araştırmacıların DNA metilasyonunu ve bunun insan hastalıklarındaki rolünü keşfetmelerinin yolunu açmıştır.