DNA Metilasyonu: bisülfit modifikasyonu ve Analiz

Bu prosedürün genel amacı, sülfit dönüştürülmüş DNA ile genomik dizileme yoluyla CPG Dinükleotidlerinin DNA metilasyon analizini mümkün kılmaktır. Bu, bisülfit dönüşüm reaksiyonunun gerçekleşebilmesi için çift sarmallı DNA'nın ilk denatüre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, genomik DNA'daki metillenmemiş sitozinlerin tamamını bi sülfit deaminasyonu ile urasile dönüştürmektir.

Bu reaksiyon üç aşamadan oluşur. Birincisi, beş altı çift bağa B sülfit ilavesiyle sitozin kalıntısının sülfatlanmasıdır. İkinci olarak, sitozinin sülfit türevi ile hidrolik deaminasyonu, sülfit türevi ile bir SSL üretir ve üçüncü olarak, sülfonat grubunun alkali muamelesi ile uzaklaştırılması, bir SSL kalıntısı ile sonuçlanır.

Daha sonra, hedef bölge bi sülfit dönüşümüne özgü primerler ve PCR amplifikasyonu ile amplifiye edilir. Son adım, DNA molekülü boyunca metilasyon için tek nükleotid çözünürlüğü vermek üzere PCR ürününün klonlanması ve dizilenmesidir. Sonuç olarak, sonuçlar, asidik koşullar altında bi sülfat deaminasyonuna karşı beş metil sitozine karşı sitokinin artan duyarlılığından yararlanarak genomik DNA'daki CPG Dinükleotidlerinin DNA metilasyonunu göstermektedir.

Bu tekniğin güney kan analizi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, d metilasyonunun tek nükleotid çözünürlüğüne izin verebilmesidir. Bu yöntem, kanser gibi insan hastalıklarında DNA metilasyonunun rolü gibi epigenetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. DNA örneklerini bi sülfit dönüşümü için hazırlamak için, önce iki mikrogram genomik DNA'yı bi sülfit, DNA lizis tamponu ve 37 santigrat derecede bir saat boyunca toplam 18 mikrolitre hacim ile inkübe edin.

Daha sonra, 0.3 molar'lık bir nihai konsantrasyona iki mikrolitre taze hazırlanmış üç molar sodyum hidroksit ekleyerek genomik DNA'yı denatüre edin. Numuneleri bir su banyosunda 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin, ardından iki dakika boyunca 90 santigrat derecede inkübe edin. Bir ısı bloğunda, tüpleri hemen beş dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin, DNA'nın tüpün dibinde olduğundan emin olmak için tüpleri 10 saniye boyunca 10.000 Gs'ye santrifüjleyin, denatüre DNA örnekleri artık B hücresi ile savaşmaya hazırdır.

Sülfatlama ve hidrolitik deaminasyon reaksiyonlarından önce, sülfit pH 5.0 ile 10 milimolar kinol ve doymuş sodyum metasının taze çözeltilerini hazırlayın. Sülfit ile sodyum metası doymuş bir çözelti olduğundan, küçük topaklar çözülmeden kalabilir. Sodyum metasını sülfit 208 mikrolitre ve kinol 12 mikrolitre ile 240 mikrolitrelik son hacimde denatüre DNA 20 mikrolitreye ekleyin.

Tüpleri girdaplayın ve tüm damlacıkların tüpün dibinde olduğundan emin olmak için 10 saniye santrifüjleyin. Numuneleri mineral yağ ile kaplayın. Dönüştürülecek DNA'nın miktarına ve kalitesine bağlı olarak, numuneleri 55 santigrat derecede bir su banyosunda dört ila 16 saat inkübe edin.

Oksidasyonu önlemek için bisülfit dönüşümünün karanlıkta gerçekleşmesi önemlidir. Uygun inkübasyon süresinin sonunda, sıvının tamamının tüpün dibinde olduğundan emin olmak için tüpleri bir mikro santrifüjde kısa bir süre döndürün. Daha sonra, mineral yağın hiçbirini almadan DNA çözeltisini tüpün altından dikkatlice pipetleyin.

Sonraki adımlar için laboratuvarımız promega sihirbaz DNA temizleme sistemini kullanır. DNA örneklerine bir mililitre reçine ekleyin, karıştırmak için tüpü ters çevirin, ardından çözeltiyi bir tuz giderme kolonuna bağlı bir şırıngaya pipetleyin. Son olarak, herhangi bir serbest bi sülfit iyonunu uzaklaştırmak için, bi sülfit ile muamele edilmiş DNA'yı Tuzdan Arındırma kolonundan geçirin ve 50 mikrolitre Milli Q suyunu ima edin.

Bir sonraki adım, bisülfit tavan arasını tuzdan arındırma yoluyla urasil halkasından çıkarmaktır. Bunu başarmak için, 0.3 molar'lık bir nihai konsantrasyon için her bisülfit ile muamele edilmiş DNA örneğine 5.5 mikrolitre taze hazırlanmış üç molar sodyum hidroksit ekleyin. Daha sonra numuneleri 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Numuneleri kısa bir süre santrifüjleyin ve ardından her numuneye bir mikrolitre TRNA ekleyin. Üç molar nihai konsantrasyona amonyum asetat ekleyerek çözeltiyi nötralize edin. Daha sonra etanol DNA'yı çökeltir.

Buz gibi,% 100 etanol 330 mikrolitre ekleyin ve ters çevirerek iyice karıştırın. Eksi 20 santigrat derecede bir saat bekletin, gece boyunca 14.000 GS'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Daha sonra tüm süpernatan izlerini çıkarın ve çökelmiş DNA'yı yaklaşık 20 dakika havayla kurutun.

Havayla kurutulduktan sonra, peletin DNA peletini 50 mikrolitre 0.1 XTE içinde yeniden süspanse ettiğini veya bu süre zarfında yaklaşık iki saat oda sıcaklığında su bıraktığını görmek neredeyse imkansızdır, bazen DNA'nın çözüldüğünden emin olmak için tüpleri girdaplayın, ardından hızlı bir santrifüj yapın. DNA çözündükten sonra, DNA'nın miktarına ve kalitesine bağlı olarak eksi 20 santigrat derecede bir ila 10 yıl saklanabilir veya hemen kullanılabilir. PCR amplifikasyonu için primer optimizasyonu bu prosedürün en zor yönüdür.

Bu nedenle, astar tasarım başarısını sağlamaya yardımcı olmak için aşağıdaki yönergeler sağlanmıştır. Bu yönergeleri açıklamak için, hedef dizi, yazıldığında dönüştürülmüş sitozinler mavi Ts olarak görünecek ve dönüştürülmemiş CPG bölgeleri kırmızı cgs olarak görünecek şekilde dönüştürülen sülfit ile dönüştürülmüştür, spesifikliği sağlamak için primerlerin uzunluğu 24 ila 30 baz çifti olmalıdır. Primerler, 50 santigrat derecenin üzerinde benzer şekilde tahmin edilen bir TM'ye sahip olmalı ve bir ila iki santigrat dereceden fazla farklılık göstermemelidir.

Primerler, dönüşüm özgüllüğünü sağlamak için birden fazla yaklaşık% 25 C ila T bazları içermelidir. Dönüştürülen D-N-A-C-P-G dinükleotidlerinin amplifikasyonunu sağlamak için üç asal ucun C ila T olması gereken son baz, metillenmiş, metillenmemiş veya dönüştürülmemiş şablonlara karşı potansiyel yanlılığı önlemek için primer dizisinde kaçınılmalıdır. Bununla birlikte, kaçınılmazsa, dönüştürülmüş DNA'nın tarafsız amplifikasyonunu sağlamaya yardımcı olmak için CPG bölgesindeki sitozin bir Y ile değiştirilmelidir.

Son olarak, gerekirse PCR reaksiyonunun özgüllüğünü veya hassasiyetini sağlamak için iç içe veya yarı iç içe primer setleri tasarlayın. Optimizasyon için 25 mikrolitrelik alikotlarda PCR amplifikasyon reaksiyonu karışımları hazırlayın. Her reaksiyon, metillenmiş veya metillenmemiş materyalin amplifikasyon yanlılığını test etmek için sülfit dönüştürülmüş genomik DNA DPS primerleri, magnezyum klorür, potasyum klorür tris hidroklorür pH 8.3 anac polimeraz içerir.

Bi sülfit dönüşümü ile orantılı PCR amplifikasyonunu test etmek için 50 50 metillenmemiş tam bi sülfit dönüştürülmüş kontrol numunesi kullanın. Bir sıcaklık gradyanlı termodöngüleyicide spesifik primerler ve PCR reaksiyon karışımı, çalışma reaksiyonunu primerin TM'sinden sekiz ila 10 tüp boyunca bir gradyan artı veya eksi üç santigrat derece olarak ayarlar, tüpleri girdaplar ve termocycler'a yerleştirmeden önce bir mikro santrifüjde kısa bir süre döndürür. Bu şekil, %50 metillenmiş ve metillenmemiş DNA karışımından sıcaklık gradyanı PCR amplifikasyon profiline sahip bir agros jeli göstermektedir.

PCR Amplikonları ve T şeritleri iki, beş ve sekiz ile işaretlenmiş şeritler, yalnızca metillenmiş DNA'yı sindirecek bir kısıtlama enzimi ile muamele edilmiştir, optimal PCR amplifikasyon koşulları, metillenmiş ve metillenmemiş amplikonları orantılı ve önyargısız olarak çoğaltmalıdır, bu da burada görüldüğü gibi eşit miktarda kesilmiş ve kesilmemiş PCR ürünü ile sonuçlanır. Önyargısız amplifikasyon için en uygun termodöngü koşulları 55.6 santigrat derecedir. Bisülfit DNA'nın tam dönüşümü, yalnızca dönüştürülmemiş DNA şeritleri üç, altı ve dokuz'u sindirecek olan sitozin bölgesine özgü bir enzim ile sindirim yoluyla analiz edilebilir.

Tam bi sülfit DNA dönüşümü burada, üç, altı ve dokuzuncu şeritler olmak üzere üç şeridin hepsinde kesilmiş DNA'nın olmaması ile gösterilir. Bu gerçek zamanlı ayrışma grafiği, sırasıyla 82.9 santigrat derece ve 86.9 santigrat derecede ayrışan tam metillenmiş pembe çizgi m ve metillenmemiş, DNA yeşil çizgi U'nun kontrol amplifikasyonuna kıyasla metillenmiş ve metillenmemiş DNA kırmızı turuncu çizgi 50 50 karışımının eşit bir oranını gösterir. Bu, farklı moleküllerin ayrışacağı sıcaklığa dayalı olarak herhangi bir amplifikasyon yanlılığı olmadığını gösterir.

Bisülfit ile muamele edilmiş numunelerin amplifikasyonundan elde edilen PCR fragmanları, agros jel elektroforezi ile görselleştirilebilir ve sekanslanabilir. Burada doğrudan gösterilen, sarı hücre hattı X ile vurgulanan CPG bölgelerine sahip üç farklı hücre hattından bir dizi izi, burada gösterilen örtüşen GA sinyallerinde görüldüğü gibi Y ve Z hücre hatlarının değişen derecelerde metilasyon gösterdiği üç CPG bölgesinin hepsinde %100 metilasyon gösterir. Şekil dört A, CPG bölgeleri sarı ile vurgulanmış üç farklı hücre hattından bir dizi izidir.

Tek tek klonların doğrudan dizilenmesinden sonra, tek tek moleküllerin metilasyon durumu bir bi sülfit haritasında tablo haline getirilebilir. Heterojenlik metilasyonunu görselleştirmek için, tek tek CPG bölgelerindeki metilasyon yoğunluğu kırmızı ile gösterilmiştir. Bu temsili bi sülfit haritasında, bir numunenin yüksek verimli kantitatif metilasyon analizi.

Sekel epi typer teknolojisi kullanılarak, bu örnekte gösterildiği gibi metillenmiş sitozinlerin varlığına bağlı olarak spesifik bir spektrum üretebilir Şekil beş A.Numunedeki oranların bir özeti daha sonra bir epigram şeklinde tahmin edilebilir Şekil beş B.Bu örnek, dört farklı hücre hattı için her bir CPG bölgesindeki DNA metilasyon yüzdesini gösterir. Son olarak, bir metilasyon grafiği özeti şekil beş C, geliştirilmesinden sonra epigramından türetilebilir. Bu teknik, epigenetik alanındaki araştırmacıların DNA metilasyonunu ve insan hastalıklarındaki rolünü keşfetmelerinin yolunu açtı.