Bir fare modelinde glial hücre yeniden programlaması için viral vektörlerin stereotaksik enjeksiyonu

Anestezi uygulanmış bir transgenik fareyi, kafatası açıkta kalacak şekilde stereotaksik bir çerçeveye sabitleyin.

Bu fare, glial hücrelerde Cre rekombinaz eksprese eder.

Kılcal boruyu tutan stereotaksik kolu kafatasının üzerine yerleştirin ve bregmanın üzerine hizalayın.

Hassas hedefleme için stereotaktik eksenleri ayarlayın.

Dura mater'in sağlam kaldığından emin olarak hedef bölgede bir delik açın. Kemik parçalarını çıkarın.

Kılcal boruyu tamponla yıkayın. Bir hava kabarcığı çizin, ardından aktif olmayan nöronal yeniden programlama ve floresan protein genlerini taşıyan adeno ilişkili virüsü yükleyin.

Kılcal boruyu hedef derinliğe indirin ve viral çözeltiyi glial hücre açısından zengin bölgeye enjekte edin.

Geri akışı önlemek için tüpü dikkatlice geri çekin.

Kesiği kapatın ve iyileşmeye izin verin.

İçselleştirilmiş virüsler, glial çekirdeğe loxP ile çevrili inaktive edilmiş genler iletir. Cre rekombinaz onları çevirir, nöronal yeniden programlama genlerini aktive eder ve nöronal dönüşümü yönlendirir. Yeniden programlanmış internöronlar, nörona özgü promotör altında floresan proteini eksprese eder.

Yeniden programlama faktörlerini enjekte etmek için, anestezi uygulanmış bir fareyi stereotaksik çerçeveye yerleştirin, ameliyatın başında uygun analjezi uygulayın, ardından enjeksiyon iğnesinin cam kılcal damarının ucunu bregmanın hemen üzerine getirin. Kılcal ucun hem AP hem de ML düzlemlerinde tamamen düz olduğundan emin olun. Dijital koordinat sayacında hem M-L hem de A-P değerlerini 0,0'a sıfırlayın.

Hayvanın başının tamamen düz bir konumda olduğundan emin olmak için, AP kolu artı 2.0 ve eksi 2.0 olduğunda ve ayrıca M-L kolu artı 2.0 ve eksi 2.0 olduğunda DV koordinat değerini ölçmek için dijital koordinat sayacını kullanın. Diş çubuğunun ve kulak çubuklarının yüksekliğini buna göre ayarlayın. Daha sonra, şırıngayı hafifçe kaldırın ve enjeksiyon koordinatlarında bir diş matkabı kullanarak bir delik açın.

Dairesel ve yumuşak bir şekilde çalışarak sahada delmeye başlayın. Ardından, açık kesiğin üzerine bir parça pamuklu gazlı bez yerleştirin ve şırıngayı salin solüsyonu ile yıkayın. Yıkamadan sonra, bir hava kabarcığı ve ardından viral vektörü içeren 1 mikrolitre çözelti çizin. Viral çözeltinin hava kabarcığının altında kolayca görselleştirilebildiğinden emin olun.

Daha sonra, şırıngayı indirin, istenen derinliğe yavaşça ilerleyin ve yörüngenin kemik parçalarından arınmış olduğundan emin olun. Daha sonra, dakikada 0.4 mikrolitre oranında 1 mikrolitre viral çözelti enjekte edin. Enjeksiyon tamamlandığında, şırınga çekilmeden önce difüzyon için iki dakika bekleyin.

Difüzyondan sonra, kılcal damarın ucu beyinden tamamen çekilene kadar şırıngayı yavaşça geri çekin. Ardından, insizyonu dikkatlice dikin ve hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın. Bilinç geri kazanılana kadar hayvanı postoperatif bir istasyonda izleyin.

Hayvanlar, yerleşik glia'nın olgun nöronlara yeniden programlanmasına izin vermek için virüs enjeksiyonundan sonra 12 haftaya kadar tutulur.