Fare beyninde hedeflenen nöronal gen düzenlemesi için stereotaksik viral enjeksiyon

Anestezi uygulanmış bir fareyi stereotaksik bir çerçeveye sabitleyin.

Tıraşlı kafa derisini dezenfekte edin, ardından kafatasını ortaya çıkarmak için orta hat kesisi yapın.

Kafatasını kurutun ve bregma görünürlüğünü artırmak için hidrojen peroksit uygulayın.

Bregma ve lambda'yı bulun, ardından hedef siteleri belirleyin.

Hedef bölgelerde kafatasını dikkatlice delin.

Virüs dolu şırıngayı stereotaksik alete takın.

Virüs, enfekte nöronları etiketlemek için bir floresan raportör ile birlikte dentat girus nöronlarında genom düzenleme için Cas9 ve tek kılavuzlu bir RNA'yı kodlar.

Dentat girusa ulaşmak için şırıngayı indirin, ardından düzgün dağılımı sağlamak için virüsü yavaşça enjekte edin.

Şırıngayı yavaş yavaş kaldırın ve enjeksiyonu ek koordinatlarda tekrarlayın.

Geri akışı önlemek için kısa bir süre duraklayın, ardından iğneyi yavaşça geri çekin.

İşlemi karşı yarım kürede tekrarlayın.

Son olarak, kesiyi dikin.

Model artık daha ileri çalışmalar için hazır.

Enjeksiyon bölgesine hazırlanmak için anestezi uygulanmış bir farenin kafasını tıraş edin. Burun konisine doğrudan% 4 izofluran. Ardından, fareyi stereotaksik alete yerleştirin. Kulak çubuklarını sabitlemeden önce ısırma çubuğunu dişleri yuvaya düşene kadar ağzına sokun.

Hayvanın vücudunun ısıtma yastığının üzerinde olduğundan ve burnun burun konisine yerleştirildiğinden emin olun. Ardından, bir ayak tutamağı vererek anesteziyi onaylayın. Ardından, gözleri yağlamak için suni gözyaşı uygulayın. Daha sonra, traşlı kafayı povidon iyot ve lidokain ile temizleyin.

Şimdi, kafa derisi orta hattı boyunca küçük bir kesi yapın. Kafatasını bir çubukla kurulayın ve bregmayı görselleştirmeye yardımcı olmak için hidrojen peroksit uygulayın. Bir diseksiyon dürbünü kullanarak, kafatasındaki bregmayı bulun ve matkap ucunu üzerine yerleştirin. x, y ve z düzlemlerinin dijital stereotaktik koordinatlarını 0 olarak ayarlayın.

Kafanın rostral kaudal y ekseni üzerinde hizalandığından emin olmak için, matkap ucunu lambda üzerine yerleştirin ve kafayı, z-koordinatı bregma ve lambda'da kabaca 0'a eşit olacak şekilde düzleştirin. Kafanın x ekseni boyunca hizalandığından emin olmak için, matkap ucunu bregma ve lambda arasındaki orta noktaya yerleştirin ve eşit olduklarından emin olmak için her iki taraftaki orta noktadan 1 milimetre uzakta z koordinatlarını ölçün.

Ardından, matkabı istenen koordinatların üzerine yerleştirmeden önce izofluranı %2'ye düşürün ve kafatasını dikkatlice delin. Tüm delikleri açtıktan sonra, virüs dolu şırıngayı stereotaksik alete yapıştırın. Şırıngayı deliğin üzerine ortalayın ve kafatasındaki z koordinatını 0'a ayarlayın. Şırıngayı yavaşça en derin z derinliğine indirin ve stereotaksik bir enjektör kullanarak dakikada 0,25 mikrolitre oranında enjeksiyona başlayın.

Enjeksiyon en derin z derinliğinde tamamlandıktan sonra, bir sonraki koordinata yükseltmeden önce bir dakika bekleyin ve tekrar enjeksiyona başlayın. Tüm z-enjeksiyon koordinatları enjekte edilene kadar bu modele devam edin. Son enjeksiyondan sonra, şırıngayı çıkarmadan önce iki dakika bekleyin. Ardından, fareyi stereotaksik aletten çıkarın ve kafa derisini dikin. Ameliyat bölgesine lidokain ve antibakteriyel krem uygulayın ve hayvanı ısıtılmış bir iyileşme odasına aktarmadan önce ağrı kesici ilaçlar uygulayın.