Bir tavuk embriyosunda nöral ve vasküler ağların görselleştirilmesi

Erken evre bir embriyo içeren pencereli, döllenmiş bir tavuk yumurtası ile başlayın, nöral tüpü bir ila yedi somit seviyesinde eksize edilir.

Evre uyumlu bir transgenik tavuk embriyosundan GFP etiketli bir donör nöral tüp alın ve uygun anatomik oryantasyonu sağlayarak alıcıya implante edin.

Donör ve konakçı dokular arasındaki yapışmayı artırmak için greftin etrafındaki fazla sıvıyı çıkarın.

Dehidrasyonu ve kirlenmeyi önlemek için pencereyi şeffaf bantla kapatın.

Embriyo istenen aşamaya gelene kadar yumurtayı kuluçkaya yatırın.

Bandı çıkarın.

Yumurta sarısı üzerinde kanı embriyoya doğru taşıyan bir vitellin damarı tanımlayın ve üstteki vitellin zarını çıkarın.

Bir cam iğne kullanarak, damar içine sürekli olarak lipofilik bir floresan boya enjekte edin.

Embriyoyu stereofloresan mikroskobu altında görselleştirin.

Enjekte edilen boya, kan damarlarını kaplayan endotel hücrelerine bağlanarak vasküler ağı vurgularken, GFP etiketli nöral tüp, sinir ağının izlenmesini sağlar.

Greftleme prosedürüne başlamaya hazır olduğunuzda, disseke edilmiş nöral tüpü saat camından konakçı embriyoya dikkatlice aktarın. Nöral tüpü doğru yönde konumlandırın. Ve bitişikteki eksplantı, eksize edilen bölgeye nazikçe itin. Gerekirse, eksplantı, eksize edilen bölgenin tam boyutuna getirmek için mikro neşteri kullanın.

Doğru pozisyona geldikten sonra, donör ve konakçı dokuların yapışmasına ve grefti oluşturmasına yardımcı olmak için PBS ve diğer sıvıları çıkarın. Aşılanmış GFP pozitif nöral tüpün vahşi tip tavuk konakçıya başarılı bir şekilde entegrasyonu, bir floresan mikroskobu altında değerlendirilebilir. Dehidrasyonu ve kontaminasyonu önlemek için tüm pencereyi 24 milimetre genişliğinde şeffaf bantla kapatın.

Kimerik embriyoyu etiketleyin. Ve daha fazla gelişme için yumurtayı kuluçka makinesine geri koyun.

İstenilen deneysel zaman noktasında, yumurtayı kuluçka makinesinden alın. Ve embriyoya erişmek için şeffaf bandı çıkarın. Görünür hale geldikten sonra, yumurta sarısı üzerinde erişilebilir bir damar bulun ve kan akışının embriyoya doğru yönlendirildiğinden emin olun.

Enjeksiyon yeri için vitellin damarlarından birinde bir dallanma noktası seçin. Zıt yönlerde yırtarak seçilen enjeksiyon noktasının üzerindeki vitellin zarını çıkarmak için cımbız kullanın. Ardından, çekilmiş bir cam iğnenin çapını damarın boyutuna göre ayarlayın.

İğneyi 5 ila 10 mikrolitre DiI çözeltisi ile doldurun. İğneyi hızlı bir şekilde damarın içine sokun. Ve DiI'nin pıhtı oluşturmadan yavaşça kan akışına katılmasını sağlamak için ağız tüpüyle sabit bir şekilde üfleyin. DiI enjeksiyonunun başarısı, embriyonun bir floresan mikroskobu altında kısaca görüntülenmesiyle değerlendirilebilir.