Fare hipokampüsünde mikroglial dinamiklerin in vivo iki fotonlu görüntülenmesi

Mikroglia'da floresan proteinleri eksprese eden anestezi uygulanmış bir transgenik fareyi ele alalım. İki fotonlu bir mikroskop altında motorlu bir tablaya sahip stereotaksik bir çerçeveye sabitleyin.

Kafatası, alveusu hipokampal kornu ammonis 1 veya CA1 bölgesinin üzerinde nazikçe düzleştiren ve alttaki doku üzerinde aşırı baskı olmadan net bir optik arayüz sağlayan cam tabanlı bir metal tüp ile donatılmıştır

.

Optik iletimi optimize etmek için metal boruyu suyla doldurun.

Darbeli lazeri uyarma dalga boyunda etkinleştirin.

Beyin parankiminden gelen floresan ve metal tüpten yansıyan ışığı kullanarak, CA1 bölgesine odaklanmayı ayarlayın.

Farenin kafasını, cam tabanı görüntüleme düzlemine paralel olarak hizalamak için yeniden konumlandırın ve görüş alanı boyunca eşit odak sağlayın.

Optimum çözünürlük için hedefi ayarlayın ve CA1 bölgesindeki in vivo mikroglial dinamikleri gözlemleyin.

Ardından, floresan mikroglianın CA1 bütünlüğünü onayladığı dentat girusu görüntüleyin.

Fareyi, iki fotonlu mikroskobun objektif merceğinin altındaki baş tutma cihazına ve motorlu XY tarama aşamasına yerleştirin. Ardından cam alt kısım ile objektif lens arasındaki boşluğu hava kabarcıkları oluşturmadan suyla doldurun. Darbeli lazer tarafından sürekli aydınlatma altında, beyin parankiminden yayılan floresan ve metal tüpün kenarından yansıyan ışığın rehberliğinde odağı CA1'e ayarlayın.

Kafa tutma aygıtını, cam alt kısım görüntüleme düzlemine paralel olacak şekilde eğerek fare kafasının açısını ayarlayın. Ardından, CA1'deki hedef yapının derinliğinde en yüksek çözünürlüğü elde etmek için hedefin düzeltme bileziğini ayarlayın. Daha sonra, cam tabandan 500 mikrometre derinlikte dentat girusun veya DG'nin moleküler katmanındaki floresan hücrelerin tüm görüş alanında görüntülendiğini onaylayın. Sadece başarılı bir ameliyat durumunda, DG sinyalleri hemen tespit edilebilir.

Mikroglia'nın dallanmış morfolojilerini geri kazandığından emin olun. Ardından, CA1'deki ilgili katman üzerinde in vivo görüntüleme gerçekleştirin.