Fare Sinir Uçlarında Hızlı Kalsiyum Geçişlerinin Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Görüntülenmesi

Konfokal mikroskop altında konumlandırılmış güvenli bir fare kası içeren silikon elastomer kaplı bir deney odası ile başlayın.

Kas, kas kasılmalarını bloke eden inhibitörler içeren fizyolojik bir çözeltiye daldırılır.

Floresan kalsiyum boyası ile işaretlenmiş sinir kütüğü, bir elektrik stimülatöre bağlı olan emme elektrodunun içine yerleştirilir.

Nöromüsküler kavşakta, periferik sinir kasa bağlanır.

Elektrodu kullanarak sinire elektriksel bir uyarı uygulayın. Bu, hücre içi kalsiyum boyasına bağlanan hızlı bir kalsiyum iyonu akışını tetikler.

Kalsiyum boyayı uyarmak için nöromüsküler kavşağı aydınlatın ve floresan oluşmasına neden olun.

Ardından, periferik sinir uçlarındaki hızlı kalsiyum geçişlerini kaydetmek için yüksek çözünürlüklü görüntüler yakalayın.

İlgilendiğiniz bölgeyi seçin ve floresan yoğunluğunu ölçün.

Floresan yoğunluğundaki hızlı bir artış, periferik sinir uçlarında kalsiyum akışını gösterirken, bir azalma kalsiyum klerensini yansıtır.

Perfüzyon sistemini 10 mikromolar D-tubokurarin içeren Ringer solüsyonu ile doldurun ve perfüzyonu başlatmak için perfüzyon emme pompasını açın. Lazer Taramalı Konfokal Mikroskopta veya LSCM yazılımında, görüntüleme parametrelerini ayarlamak için elektrofizyoloji ve edinim modunu seçin. İş menüsü ayarlarında, stimülatörü mikroskop senkronizasyon darbesiyle tetiklemek için Tetik ayarlarını seçin ve Çerçeve Alanında Tetik Çıkışı'nı OUT 1 kanalına ayarlayın.

Tarama modunu 1.400 Hertz tarama frekansında xyt'ye çevirin. Yakınlaştırma faktörü, iğne deliği tamamen açıkken 6.1 olmalıdır. Sıralı geçiş çift yönlü x modunun açık olduğundan emin olun. Ardından, bir kare oluşturmak için minimum süreyi 52 milisaniye olarak ayarlayın ve ham videodaki kareleri 20 karede toplayın. Argon lazerin uyarma dalga boyunu, çıkış gücünün% 8'i ile 488 nanometre olarak ayarlayın.

Parametreler ayarlandığında, boya yüklü sinir terminallerinin canlı önizlemesini almak için Canlı Mod düğmesine basın. Canlı modda, en iyi odağı elde etmek için İlgi Bölgesini veya ROI'yi arayın, ardından stimülatör üzerindeki gecikmeyi önceki değere göre 2 milisaniye daha az kaydırın. Ve her diziyi bir öncekinden iki milisaniye kaydırarak 26 dizi elde etmek için veri toplama yazılımını çalıştırın.