Bio Flip-Chip kullanarak Embriyonik Kök Hücreler, Desenlendirme
1 Ekim 2007
Biz, bir substrat üzerindeki istenilen noktada hücre yerleştirmek için basit bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu yöntem desen hücreleri yüzeye hücreleri ile dolu mikro oyukların içeren bir silikon çip saygısız. Bu yöntem yayılabilir ve juxtacrine hücreleri arasındaki sinyal modüle etmek için yeni bir yol sağlar.
Ben Nikel Mital. Bowman laboratuvarında lisansüstü öğrencisiyim. Bugün sizlere, laboratuvarımızdaki iki eski öğrenci tarafından geliştirilen ve bio flip chip olarak adlandırılan cihazdan bahsedeceğim.
Bu cihaz, hücrelerin deneycinin seçtiği bir alt tabaka üzerinde ve tercih ettiği bir konfigürasyonda iletilmesini sağlar. Cihazın kendisi -burada bir örneği mevcut- oldukça basittir. Temel olarak bir silikon parçası içindeki küçük kuyucuklardan oluşur.
Her bir kuyu genellikle yalnızca tek bir hücreyi tutacak şekilde tasarlanmıştır, ancak gerekirse bunları elbette daha büyük yapabiliriz. Cihazın üretimi, kuyuların hücrelerin nihayetinde substrat üzerinde yer alacağı düzenle aynı olacak şekilde gerçekleştirilir. Dolayısıyla cihazın kendisi, yumuşak litografi yöntemleri kullanılarak üretilmiştir.
Özellikle, poli dimetil siloksan olan PDMS kullanıyoruz ve bunu bir silikon gofret üzerinde kalıpluyoruz. Burada bunlardan bir tane var. Kalıp gofretin kendisi, silikon gofrete spin kaplama yöntemiyle uygulanan bir SU-8 fotoresisti desenlemek için standart fotolitografi kullanılarak üretilmiştir.
Özetle, biyoflip çip üzerindeki kuyucuklar bu hücrelerle doldurularak hücreler seçilen substrata aktarılır. Ardından çip, genellikle polistiren doku kültürü olan seçilen substrata uygulanır. Son olarak, kombinasyon ters çevrilerek hücrelerin kuyucuklardan çıkıp substrat üzerine düşmesi sağlanır.
Ben Stephanie Flavin. Goldman laboratuvarında lisans düzeyinde araştırmacıyım ve bugün, bir gün önceden hücreleri desenlemek için bio flip chip'in nasıl kullanılacağını göstereceğim. Bir desenleme deneyi yapmak istiyoruz.
PDMS'yi bir inç boyutunda kare bir cam lamın üzerine plazma ile bağlayacağız. Ardından, çipi kuyu tarafı aşağı bakacak şekilde bir PBS çözeltisi içinde gece boyunca bekleteceğiz. Ayrıca, desenleme deneyinde kullanılacak contaları keseceğiz ve yine kullanılacak olan binder klipsleri toplayacağız.
Her bir çipin yüzeyine 200 µL BSA uygulayın. Kabarcıkları çıkarmak ve BSA solüsyonunun kuyucukları doldurmasını sağlamak için çip yüzeyini pipet ucuyla hareketlendirin. Çipleri, normal hücre geçişleri için UV ışığı altında, davlumbaz içinde bir saat boyunca bekletin.
Bir saat sonra BSA çözeltisini çiplerden aspire edin ve her bir çipi 200 µL PBS ile yıkayın; ardından 10⁶ hücre/mL yoğunluğunda 200 µL pasaj hücre çözeltisi uygulayın. Hücrelerin kuyucuklara çökmesi için 5 ila 10 dakika bekledikten sonra, çip yüzeyini PBS ile durulayın. Çipi yaklaşık 15 derecelik bir açıyla bir köşesine doğru eğin ve hücre çözeltisini çipin alt köşesinden yavaşça pipetle çekin.
Çipi düz konuma getirin ve üst köşeye yavaşça 50 µL PBS ekleyin. Yıkama adımını gerektiği kadar tekrarlayın. xls çip yüzeyinden temizlendiğinde, kabın iç contasına yaklaşık 50 µL besiyeri ekleyin.
Her bir çipin üst kısmına besiyeri ekleyin. Ardından, kabı ters çevirin ve bir köşeden başlayarak çipin yüzeyine doğru eğerek indirin. Daha sonra, kap ile çip arasında hava kabarcığı oluşumunu önlemek için kabı çipin üzerine tamamen düzleştirerek oturtun.
Çipi yerine sabitlemek için her iki yanına binder klipsler takın. Çip ters çevrildiğinde kap üzerinde düz durması için her bir binder klipsin kollarını çıkarın, çipi inkübatöre taşıyın ve tüm gereksiz hareketlerden kaçınarak hızlıca ters çevirin.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, bio flip chip adı verilen bir cihaz kullanarak hücrelerin bir substrat üzerine konumlandırılması için yeni bir yöntem sunmaktadır. Hücrelerle doldurulmuş mikro kuyucuklara sahip bir silikon çipin substrat üzerine ters çevrilmesiyle araştırmacılar, hücre yerleşimini etkili bir şekilde kontrol ederek hücreler arası sinyalleşmenin modülasyonunu artırabilmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre biyolojisi
- Nörobilim
- Biyomühendislik
Arka Plan
- Hücre konumlandırması, hücresel etkileşimlerin incelenmesi için kritik öneme sahiptir.
- Mevcut yöntemler, hücre yerleşimi konusunda hassasiyet eksikliği gösterebilir.
- Bio flip chip, basit ve etkili bir çözüm sunar.
- Bu teknik, hem difüzyonla yayılan hem de jukstakrin sinyallemeyi etkileyebilir.
Çalışmanın Amacı
- Substratlar üzerine hücre yerleşimi için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Hücre sinyal mekanizmalarının anlaşılmasını geliştirmek.
- Çeşitli biyolojik alanlardaki araştırmacılar için bir araç sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Biyo flip çipin tasarımı ve üretimi.
- Mikrokuyucukların hücrelerle doldurulması.
- Çipin istenen substrat üzerine ters çevrilmesi.
- Hücre yerleşiminin ve sinyalleşmenin gözlemlenmesi ve analiz edilmesi.
Temel Sonuçlar
- Hücrelerin hedeflenen konumlara başarılı bir şekilde yerleştirilmesi.
- Hücre sinyalizasyonunun geliştirilmiş modülasyonu.
- Cihazın kullanım kolaylığının gösterilmesi.
- Çeşitli deneysel düzeneklerdeki potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- Bio flip chip, hücre yerleştirme için yenilikçi bir araçtır.
- Bu yöntem, hücresel sinyal iletimi çalışmalarını önemli ölçüde etkileyebilir.
- Gelecekteki araştırmalar, bu tekniği daha geniş uygulamalar için geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Hücre popülasyonlarının hassas uzamsal kontrolü, kök hücre tabanlı hastalık modellerinde hedef doğrulama için kritik olan difüzyonla yayılan ve jukstakrin sinyal yolaklarının mekanistik olarak incelenmesine olanak tanır. Bio Flip Chip, tanımlanmış hücresel mikroortamların desenlenmesi için substrattan bağımsız ve kimyayı koruyan bir yöntem sunarak fenotipik tarama için tekrarlanabilir analiz geliştirmeyi destekler. Bu yaklaşım, hücre-hücre teması ve parakrin faktör maruziyetindeki değişkenliği azaltarak erken keşif aşamasındaki öngörü güvenini artırır ve böylece in vitro modellerden preklinik doğrulamaya geçişteki translasyonel sürekliliği iyileştirir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Lokalize hücre yoğunluğunun ve uzaysal düzenlemenin, kök hücre farklılaşması ve kendini yenileme yollarını nasıl etkilediğine dair hipotezlerin test edilmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Rastgele ekimden kaynaklanan stokastik değişkenliği ortadan kaldırarak, tekrarlar arasında tutarlı jukstakrin ve parakrin sinyal girdileri sağlar.
- Öngörücü Değer: Hedef etkileşim çalışmalarında, temas bağımlı sinyalleşme ile çözünür sinyalleşmenin katkılarını ayrıştırarak mekanistik risklerin azaltılmasını destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değeri: Yüksek içerikli görüntüleme ve çoklu okumalarla uyumlu, nicelendirilebilir ve uzamsal olarak tanımlanmış hücre dizileri oluşturur.
- Operasyonel Değeri: Substrat kimyasını değiştirmeden doku kültürü polistireni, cam, Matrigel ve besleyici tabakalar üzerinde hücre-hücre etkileşim analizlerinin standartlaştırılmasını sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Hücre dışı matriks desenleri oluşturmak için mikrotemas baskılama yöntemiyle uyumludur; bu da adezyon ve sinyal uyarılarının kombinatoryal kontrolüne olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Konjenital bozukluklar ve rejeneratif tıp ile ilgili gelişimsel sinyal yolaklarını modellemek için embriyonik kök hücreleri tanımlanmış nişlerde desenler.
- Preklinik Modelleme: Morfojenlerin veya terapötiklerin uzaysal olarak kontrollü mikroortamlarda doz-yanıt analizini kolaylaştırarak fizyolojik uygunluğu artırır.
- Riskten Arındırılmış İlerleme: Kontrolsüz hücre agregasyonu veya değişken temas frekansından kaynaklanan gürültüyü minimize ederek, öncü bileşik tanımlama sürecindeki yanlış pozitifleri azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bio Flip Chip, bileşik maruziyeti öncesinde kök hücrelerin tekrarlanabilir şekilde desenlenmesini sağlayarak erken keşif iş akışlarına entegre olur; böylece lider optimizasyonunda hipotez odaklı taramayı ve mekanistik takibi destekler.
- Keşif Biyolojisi: Embriyonik kök hücrelerin tanımlanmış uzaysal organizasyonunun, soy belirlemesini ve yolak aktivitesini nasıl modüle ettiğini test eder.
- Tarama: Bileşiklerin kontak bağımlı ve difüzyonla yayılan sinyalleme üzerindeki etkilerini değerlendirmek için standardize, tekrarlanabilir hücresel substratlar sağlar.
- Analitikler: Desenli ko-kültürlerde bağımlı değişkenler olarak marker ekspresyonunun, proliferasyonun ve apoptozun kantitatif uzaysal haritalamasını sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Klinik öncesi hedef seçimini bilgilendirmek amacıyla, insan gelişimsel sinyal kaskadlarını uzaysal olarak kontrollü sistemlerde modeller.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Projeler genelinde birden fazla hücre tipine, substrata ve hücre dışı matriks konfigürasyonuna uyarlanabilen modüler bir desenleme platformu olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kontrolsüz hücre-hücre etkileşimlerinden kaynaklanan biyolojik gürültüyü azaltarak hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Ekim tekniği değişkenliğinden bağımsız, hassas ve kullanıcı tanımlı hücre yerleşimi yoluyla analiz tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Stratejik Değer: Hücreler arası iletişimi hedefleyen fenotipik taramalarda sinyal-gürültü oranını iyileştirerek devam/dur kararı verme verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Kök hücre kaynaklı hastalık alanlarında jukstakrin yolakların (örneğin Notch, Wnt) modülatörlerinin riskle uyumlu önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Çip üretimi veya temini için yumuşak litografi ve PDMS kullanımı konusunda uzmanlık gerektirir.
- Substrat hazırlığı için plazma bağlama ekipmanına ve UV/ozon işlemine erişime bağlıdır.
- Kuyucukların verimli bir şekilde doldurulmasını ve serbest bırakılmasını sağlamak için standartlaştırılmış hücre hazırlama ve yıkama protokolleri gereklidir.
- 3D matrislere veya mikroakışkan sistemlere uyarlama, ters çevirme zamanlamasının ve yüzey enerjisinin optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlama: Tek hücre için tasarlanmış kuyucuklara birden fazla hücre yüklenmesini önlemek amacıyla, kuyucuk doluluk oranı her hücre tipi ve boyutu için ampirik olarak belirlenmelidir.
