Cut-yükleme: Retina Nöronlar arasında Gap Junction Tracer Kaplin Kapsamı incelenmesi için yararlı bir araçtır

Aşağıdaki kesik yükleme deneyinin genel amacı, kontrollü aydınlatma koşulları altında sağlam retinadaki nöronlar arasındaki boşluk bağlantı izleyici eşleşmesinin kapsamını incelemektir. İlk adım, açık boşluklu bağlantı kanallarından yayılabilen, ancak hücre zarlarından yayılamayan bir izleyici molekül olan nöro biotin çözeltisine batırılmış keskin bir bıçakla retinaların kesilmesiyle elde edilir. İkinci adımda, retinalar, açık boşluklu bağlantı kanallarından izleyici difüzyonuna izin veren ringer solüsyonunda inkübe edilir.

Boşluk bağlantı eşleşmesi zayıfsa, nöro biyotin floresansı, kesime yakın retinal nöronlarla sınırlı olacaktır. Buna karşılık, boşluk bağlantı bağlantısı güçlüyse, floresan kesimden uzaktaki retinal nöronlarda tespit edilecektir. Kesi yüklemenin mevcut tekniklere göre en büyük avantajı, sağlam nöral retina dokusunda küçük hücre gövdeli nöronlar üzerinde gerçekleştirilmesinin daha kolay olmasıdır.

Ayrıca, kesme yüklemesi sırasında aydınlatma koşullarını kontrol etmek, sağlam retina dokusundaki tek nöronların elektrofizyolojik bir incelemesinden daha kolaydır. Elektriksel kayıt sırasında kullanılan ışık uyaranları, boşluk bağlantı bağlantısında değişikliklere yol açabileceğinden, tekniği gösteren Dr.Chu Choi, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olacak. Bu prosedürde, bir akvaryum balığı ameliyattan önce en az bir saat boyunca gün içinde sürekli karanlıkta tutulur ve retina dokusu sabitlenene kadar aşağıdaki adımların tümü de gün boyunca sürekli karanlıkta gerçekleştirilir, akvaryum suyuna litre başına 150 miligram metan sülfonat ekleyerek akvaryum balığı derinlemesine uyuşturulur.

Daha sonra akvaryum balığını federal ve üniversite yönergelerine göre feda edin ve gözbebeklerini dikkatlice çıkarın. Ardından, her bir göz küresinin ön kısmını çıkarın. Daha sonra gözün arka kısmının üzerine bir parça filtre kağıdı yerleştirin ve filtre kağıdı ile gözü, gözün arka kısmının altında olacak şekilde ters çevirin.

Şimdi, karanlığa adapte olmuş akvaryum balığından sklera ve pigment epiteli de dahil olmak üzere gözün arkasını nazikçe çıkarın. Retina optik siniri ince bir makasla kesti. Nöral Japon balığı, retina yönelimli fotoreseptör tarafı yukarı bakacak şekilde, balık gözün arka kısmından sağlam nöral retinanın diseksiyonunu takiben altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna test ilacı olsun veya olmasın karbonat bazlı ringer solüsyonu ile oksijenlendirilmiş beş mililitrede anestezi uygulanırken, enükleasyondan önce filtre kağıdına takılmalıdır.

Sürekli karanlıkta retinaları kuyulara aktarın. Daha sonra kuyucukları paraform ile kapatın ve dokunun 30 dakika inkübe etmesine izin verin. Retinayı kesmeden hemen önce% 0.5 nöro biotin'i zil çözeltisi içinde çözerek 100 mikrolitre izleyici çözeltisi hazırlayın.

Ardından, nöro biotin solüsyonunu bir cam petri kabına ekleyin. Ardından, retinanın takılı olduğu filtre kağıdını bir kağıt havluya hafifçe vurun. Fazla halkaları çıkarmak için, bir tıraş bıçağını nöro biyotin solüsyonuna batırın ve retina ve filtre kağıdından dikey bir radyal kesim yapın.

Bundan sonra, tıraş bıçağını tekrar nöro biyotin solüsyonuna batırın ve retinayı ikinci kez kesin. Bunu retina başına dört kesime kadar tekrarlayın. Bu adımda, yükleme ve difüzyona izin vermek için retinayı 15 dakika boyunca test ilacı olan veya olmayan taze halkalara, ortama aktarın.

Her biri beş dakika boyunca test ilacı olan veya olmayan orta boy taze zil sesleriyle üç kez yıkayın. Daha sonra retinayı %4 para formaldehit ile oda sıcaklığında 0.1 molar fosfat tampon çözeltisinde bir saat sabitleyin. Daha sonra, retinayı ertesi gün buzdolabına koyarak gece boyunca dört santigrat derecede 0.1 molar PBS ile yıkayın.

Retinayı 0.1 molar PBS'de% 2 streptavidin Alexa 4 88 ve% 0.3 Triton X 100 ile mililitre başına 10 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona reaksiyona sokun ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün. Retinayı oda sıcaklığında her seferinde 10 dakika boyunca 0.1 molar PBS ile üç kez yıkayın.

Retinayı PBS'deki filtre kağıdından ayırın. Ardından ince bir fırça kullanarak, retina fotoreseptör tarafı yukarı bakacak şekilde vektör kalkanı montaj ortamına sahip bir kızağa monte edin. Slaytı bir lazer taramalı konfokal mikroskoba aktarın ve her deney koşulu için aynı büyütme, çözünürlük ve ayarlarda resimler çekin, böylece farklı deney koşullarının boşluk fonksiyonel izleyici kuplajının kapsamı üzerindeki etkilerinin karşılaştırmaları gösterilebilir.

Burada, sürekli karanlıkta gün boyunca, biri seçici bir dopamin D, iki reseptör antagonisti varlığında sürekli karanlıkta gün boyunca ile karşılaştırıldığında fotoreseptör hücre izleyici eşleşmesinin kapsamı verilmiştir. Her iki resimdeki jilet kesiminin solda olduğuna dikkat edin. Tek bir görüntü tüm etiketli hücreleri içerebilse de, ilgi alanının Z yığınını toplamanız ve bunu gösterilen tek bir görüntüye daraltmanız önerilir.

İşte böyle bir Zack boyunca sırayla hareket ederken fotoreseptör hücre izleyici eşleşmesinin kapsamı. Bu resimdeki jilet kesiminin sağda olduğuna dikkat edin. LSM görüntü tarayıcısında izleyici eşleşmesinin kapsamını ölçmek için, görüntüyü açın, ardından dışa aktar'a tıklayın ve resmi, NIH görüntü J yazılımı kullanılarak bu TIFF görüntüsüne TIF 16 bit sıkıştırılmamış bir dosya ölçek çubuğu dahil edilmelidir.

Delik montajlı retinaların düşük büyütmeli görüntülerinden Alexa 4 88 etiketli nöro biyotinin floresan yoğunluğunu ölçün. Image J yazılımını kullanarak TIFF dosyasını açın ve ardından ölçek çubuğuna karşılık gelen düz bir çizgi çizin. Ardından, analize gidin, ölçeği ayarlayın ve bilinen mesafeyi ve uzunluk birimini girin.

Ardından Tamam'ı tıklayın. Artık floresan ölçümleri milimetre gibi kalibre edilmiş birimlerde sunulabilir. Bunu takiben, dikdörtgen seçim aracını kullanarak ilgilendiğiniz alanı seçin.

Floresan tepe noktası, seçiminizin sol kenarına yerleştirilmelidir. Sağ kenarın yakınında floresan sinyali olmadığından emin olun. Sabit karanlıkta elde edilen gündüz kontrol verileri için analiz et ve profili çiz'e tıklayın.

Üstel bozulmaya sahip bir eğri soldan sağa doğru görüntülenir. Ardından açılır pencerede kopyala'yı tıklayın ve Excel'e yapıştırın. Şimdi, biri kesime olan mesafeyi, diğeri ise kesime olan mesafenin bir fonksiyonu olarak floresan yoğunluğunu gösteren iki sütun var.

Karşılaştırma olarak, yukarıdaki adımlar gün içinde sürekli karanlıkta elde edilen verilerle tekrarlanır. Tükürük kardeşimin varlığında, bağıl floresan yoğunluğunu elde etmek için her ham floresan değerini maksimum floresan değerine bölün. Kesimden uzaklığa ve bağıl floresan yoğunluğuna karşılık gelen iki sütunu kopyalayın ve ardından bunları kaynak yazılımına yapıştırın.

Bu adımlar hem gündüz kontrolü hem de gündüz tükürüğü için gösterilmiştir. Bu noktada çalıştırma verileri, sonuçları üstel bozulma ile eşleştirir. Bir numaralı fonksiyon, bir T-testi veya Inova kullanarak farklı deney koşullarında uzay sabiti değerlerini karşılaştırın.

Karşılaştırma için gündüz kontrolü, gündüz pip rone ve gece kontrol verilerinin üstel fonksiyonları ve istatistiksel analizleri gösterilmiştir. Gösterilen. Burada, karanlığa adapte olmuş Japon balığı retinasında A günü, B gecesi ve gündüz bir seçici dopamin D iki reseptör antagonistinin varlığında, kesik yükleme tekniği ile ortaya çıkan fotoreseptör hücre izleyici eşleşmesinin derecesine ilişkin örnekler verilmiştir. Tüm konfokal görüntüler, karşılaştırma için aynı ayarlar kullanılarak çekildi.

Bu grafikte, üç deneysel koşul için floresan yoğunluğu, kesimden uzaklığın bir fonksiyonu olarak çizilir ve üstel fonksiyon tarafından uydurulur. Kesme yükleme tekniği, üç deneysel koşul için burada gösterildiği gibi boşluk sabiti değerlerini hesaplayarak boşluk bağlantısal izleyici bağlantısının kapsamını ölçmek için kullanılır. Kesik yükleme tekniği, retinadaki ve diğer türlerdeki diğer hücre tipleri arasındaki elektriksel sinapsları araştırmak için de kullanılabilir.

Örneğin, bu iki şekil, tavşan, A tipi ve B tipi yatay hücrelerin, karanlığa uyarlanmış koşullar altında nöro biyotinin homolog izleyici eşleşmesini, kesilmesini, yüklenmesini ve difüzyonunu izlediğini göstermektedir. Gündüz ve gece çubuklar ve koniler arasındaki boşluk bağlantılarından izleyici difüzyonunun kapsamını incelemek için kesme yükleme tekniğini kullandık. Ek olarak, bu teknik, diğer retina nöronları arasındaki izleyici eşleşmenin retina saati tarafından mı yoksa belirli açık karanlık koşullar tarafından mı kontrol edildiğini belirlemek için kullanılabilir.

Ayrıca, diğer beyin bölgelerindeki nöronlar arasındaki izleyici eşleşmeyi incelemek için de kullanılabilir.