Name: Zoledronate İnsan Periferik Kan Genişleme γδ T Hücreler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Öğrenin, zoledronat ve IL-2 kullanarak insan periferik kan γδ T hücrelerini büyük ölçekte genişletme yöntemini. Bu teknik, kanser immünoterapisi için otojen hücresel tedaviye uygundur ve akış sitometrisi ile doğrulanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. PBMC, izolasyon <ol><li> BD Vacutainer CPT Hücre Hazırlık Tüp Sodyum Heparin ile kan (7,5-8,0 ml) çizin. Tüp sodyum heparin, antikoagülan ve Ficoll Hypaque yoğunluğu sıvı, artı, iki sıvı ayıran bir polyester jel bariyer, içerir. 1800 x g'de 20 dakika boyunca yatay bir rotor (dışarıya başını) oda sıcaklığında (18 ° C - 25 ° C) tüp / kan örneği santrifüjleyin . Frenler santrifüj geçin. </li><li> Santrifüj sonra, katmanlar dizisi (yukarıdan aşağıya doğru görülen) aşağıdaki gibi oluşur: a) plazma b) periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) ve trombositler - c) yoğunluk çözüm - d) polyester jel - e) granülositler - f) kırmızı kan hücreleri (Şekil 1). </li><li> Interfaz yukarıda plazma hücre katmanı bozmadan 5 ila 10 mm bırakarak, plazma tabakasının bir kısmını toplayın. Plazma kültür (bölüm 2.5) için kullanılabilir. </li><li> Interfaz bir pipet ve 15 ml konik tüp transferi ile zenginleştirilmiş fraksiyonu (hücre) Hasat. </li><li> 10 ml PBMC yıkayın fosfat tamponlu salin (PBS), tersine tüp ile 5 kez ve daha sonra x 400 g de 5 dakika süreyle santrifüj. </li><li> Yıkama adımları iki kez tekrarlayın ve sonra 5 ml PBS içinde hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Hücre sayısını belirler. Genellikle 6 hücreli 1,3 x10, 1 ml tam kan kurtarıldı . </li><li> Frekans ve flow sitometri (Bölüm 3) (Şekil 2) tarafından hücre γδ T hücre fenotipi belirleyin. </li></ol> 2. Γδ T hücreleri, Genişleme <ol><li> 400 x g oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 15 ml konik tüpler hücre süspansiyonları Santrifüj ve süpernatantlar atın. </li><li> Kültür vasatı (CM), sırasıyla 1000 IU / ml ve 5 mcM son konsantrasyonlarda insan IL-2 (IL-2) ve zoledronate (Zometa) ekleyerek hazırlayın. ALyS203 (Hücre Bilim ve Teknoloji Enstitüsü) veya OpTmizer (Invitrogen) medya γδ T hücreleri (6 ve 9 referanslar daha fazla bilgi) iyi bir genişleme destek. Zometa sıvı formda (4 mg/5-ml flakon) sağlanır. 5 mcM çözelti hazırlamak için, 30 ml kültür ortamı Zometa 50 ul ekleyin. </li><li> Yeniden süspanse kültür ortamında hücre pelet ve 1x10 6 hücre / ml ayarlayabilirsiniz. </li><li> 24 plaka her kuyuya 1x10 6 hücre içeren CM pipetleyin 1 ml. Büyük ölçekli kültürleri için, hücre plaka kuyuları, tabak, ya da balonun yüzey alanlarına göre 2, 0.5 x 10 6 hücre / cm az numaralı seribaşı olabilir. </li><li> Kültür (24 plaka her bir kuyu için 100 ul) hacmi yaklaşık% 10 olduğunu otolog plazma (bölüm 1.3), toplanmış insan AB sera ya da FCS ekleyin. 37 nemlendirilmiş bir tabak koyun ° C,% 5 CO 2 kuvöz 24-48 saat. </li><li> 0.5-2 x 10 6 hücre / ml bir hücre yoğunluğu kültür koruyun. Her 2-3 günde bir insan IL-2 (1000 IU / ml) (Zometa olmadan) içeren taze orta ekleyin ve hücre proliferasyonu derecesi (Şekil 3) göre, kültür hücreleri gerektiğinde yeni kuyu veya şişeler içine aktarmak . Kaynağı plazma veya serum konsantrasyonu en az% 1 korunabilir böylece orta serum. </li><li> 12-14 gün ve sıklığı, fenotip ve flow sitometri γδ T hücreleri (aşağıya bakın) fonksiyonları belirlemek Hasat hücreleri. </li></ol> 3. Flow sitometri ile fenotipik analizi <ol><li> Floresan ile aktive olan hücre sıralama (FACS) boruları 2 x 10 5 hücre içeren 200 ul örnekleri aktarın. </li><li> 2 ml soğuk PBS ekleyin ve 5 dakika boyunca 400 x g santrifüj. Ardından, 50 ul FACS tamponu (PBS +% 1 FCS +% 0.1 sodyum azid) pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Örnekleri (monoklonal antikorlar Tablo 1'de yer alan) her antikorların 5 ul ekleyin. </li><li> 20 dakika süreyle karanlıkta buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Her bir numune için 2 ml FACS tampon ekleyin ve sonra vorteks. 4 x 400 g ° C 5 dakika Santrifüj örnekleri Süpernatantı dikkatlice süzün. </li><li> 300 ul FACS tampon ve vorteks hücrelerin tekrar (Şekil 2) bir akış sitometresinin örnekleri analiz. </li></ol> 4. IFN-γ üretimi tahlil 10 <ol><li> RPMI 1640 orta artı Zometa (5 mcM) (bundan sonra Z DAUDI belirlenen) ile bir gecede% 10 FCS (RPMI-10) gün önce tahlil, kültür 3-5 x10 5 DAUDI hücre / ml stimülatörü hücreleri hazırlar. </li><li> 2x10 6 hücre / ml RPMI-10 Z-DAUDI ve tekrar süspansiyon toplayın. Yuvarlak bir alt 96 plaka her bir kuyu için 100, Z-DAUDI 5) (2x10 ul ekleyin . </li><li> RPMI-10 A 20 mg / ml Brefeldin içeren 2x10 6 hücre / ml γδ T hücreleri hazırlayın. Her bir kuyunun Z-DAUDI hücreleri içeren γδ T hücre süspansiyonu (2x10 5) 100 ul transferi veya kuyulardan (100 sadece RPMI-10 ul, ya da phorbol 20 ng / ml, 12-miristat 13-asetat ile RPMI- 10 kontrol[PMA] artı 2 mcg / ionomycin ml). </li><li> Birkaç kez aşağı yukarı pipetleme karıştırın. 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör 4 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g plaka Santrifüj ve soğuk PBS 200 ul pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> FACS tüpler örnekleri aktarın. 4 ml soğuk PBS ekleyin ve 4 x 400 gr az 5 dakika süreyle tüpler santrifüj ° C </li><li> FITC-konjuge anti-TCRVγ9 (5 ul) ve anti-CD3 PE/Cy5-conjugated mAb (ul 2.5) ile 50 ul FACS tampon pelet tekrar Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe ışıktan korunmalıdır. </li><li> IntraPrep reaktif 1 100 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 400 x g oda sıcaklığında 5 dakika boyunca her santrifüj tüpü ve 4 ml PBS ekleyin. </li><li> Aspirasyon ile süpernatantı ve IntraPrep reaktif 2 100 ul ekleyin. Titreme olmadan oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> PE-konjuge anti-IFN-γ mAb test tüpüne 5 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe ışıktan korunmalıdır. </li><li> 400 x g oda sıcaklığında 5 dakika boyunca her santrifüj tüpü ve 4 ml PBS ekleyin. Aspirasyon ile süpernatantı ve FACS tampon 0.5 ml hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Akış sitometresinde hücreleri analiz edin. CD3 + TCRVγ9 + hücreler Kapısı ve IFN-γ (Şekil 4) ifadesidir incelemek. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Hücre kültür başlangıcında γδ T hücrelerinin yüzdesini belirlemek için önemlidir. Şekil. 2 A, CD3 + TCRVγ9 yüzdesi + γδ T hücreleri, hücre içinde 0. günde% 1.6 idi . Merkezi bellek fenotipleri - baskın popülasyonları CD27 + CD45RA + naif ya da CD27 + CD45RA . Γδ T hücreleri etkin bir şekilde uyarılır, (Şekil 3 A ve B) gün 3-5 kümeler oluşturdu. Küme oluşumu gecikir, büyüme gibi diğer hücre türleri, CD4 + veya CD8 + αβ T hücreleri ve NK hücreleri γδ T hücreleri (Şekil 3 C ve D) büyüme hakim olabilir. 14 gün sonra kültür, γδ T hücrelerinin sıklığı% 93.8 başarılı γδ T hücre kültürleri (Şekil 2 E) kültür hücreleri daha fazla arttı. Kültürlü γδ T hücreleri upregüle NKG2D ve CD69 ekspresyonu (Şekil 2 G ve H). CD27 görüntülenir - CD45RA - efektör bellek fenotipi (Şekil 2 F). Sitokin üretimi ve sitotoksisiteye ilişkin γδ T hücrelerinin fonksiyonları değerlendirildi. Hücre içi IFN-γ boyama γδ T hücreleri PMA / ionomycin tedavi veya Z-DAUDI hücreleri IFN-γ üretilen olduğunu göstermiştir zoledronate tedavi sonrası biriken IPP (Şekil 4). Bu sonuçlar, bu zoledronate verimli bir şekilde uyaran ve fonksiyonel γδ T hücreleri genişletebilirsiniz göstermektedir. <table border="1"><tbody><tr><td> tüp </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> EÇG </td><td> PE/Cy5 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> CD3 </td><td> CD19 </td><td> CD45 </td><td> CD14 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> CD3 </td><td> TCRαβ </td><td> CD4 </td><td> CD8 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> CD3 </td><td></td><td></td><td> CD56 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> TCRαβ </td><td> CD45 </td><td> CD3 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> NKG2D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> CD69 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> fare IgG1 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> CD45RA </td><td> CD27 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> fare IgG1 </td><td> fare IgG1 </td></tr></tbody></table> Tablo 1 γδ T hücrelerinin çok renkli boyama kullanılan monoklonal antikorlar. Laboratuvarımızda yapılan γδ T hücrelerinin fenotipik analiz bir örnek Şekil. 2. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 PBMC ayrılması. Kan (7,5-8,0 ml) BD Vacutainer CPT Hücre Hazırlık Tüp Sodyum Heparin içine çekilir ve doğrudan 1800 x g de 20 dakika süreyle santrifüj edildi. Olarak çıkan katmanları santrifüj sonra, üstten bo görüldüttom: a) Plazma - b) hücre ve trombositler - c) Yoğunluk çözüm, d) Polyester jel e) Granülositler - f) Kırmızı kan hücreleri. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 γδ T hücreleri tipik yüzey fenotipi. PBMC 14 gün boyunca zoledronate ve IL-2 ile uyarılır. Hücreleri ile boyandı FITC etiketli anti-TCR Vγ9 ve γδ T hücreleri (A ve E) genişlemesi izlemek için anti-CD3 PE/Cy5-labeled. γδ T hücreleri TCRVγ9 kendi ifadesi ile tespit edildi ve CD27 ve CD45RA (B ve F), NKG2D (C ve G) ve CD69 (D ve H) kendi ifadesi incelenmiştir. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 Temsilcisi γδ T hücre kültürleri. Hücre IL-2 (1000 IU / ml) ve zoledronate (5 mcM) ile uyarılır. Temsilcisi alanları (IX71 inverted mikroskop [Olympus] x 200) gösterilmiştir. Γδ T hücre kümeleri ve agrega γδ T hücreleri başarılı bir şekilde genişletilmiş 3. günde (A) ve 5. gün (B) görülebilir. Γδ T hücre büyümesi (C ve D) yeterli değildi, aksine, hiçbir kümeleri veya agrega gözlendi. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4, IFN-γ üretimi . γδ T hücreleri sadece RPMI-10 (A) ya da PMA / ionomycin (B) veya 4 saat Z-DAUDI (C) ile inkübe edildi. İlk olarak, TCRVγ9 yüzey ekspresyonu boyandı ve daha sonra IFN-γ üretimi hücre içi IFN-γ boyama ile incelendi. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 γδ T hücre kültürü Kinetiği. (A) kültür hücrelerinin mutlak sayısı, (B) γδ T hücreleri, ve (C) belirtilen zaman noktalarında γδ T hücrelerinin mutlak sayısı yüzdesi.

<ol><li>Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3+T+cell+effector+functions%3A+a+blend+of+innate+programming+and+acquired+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).</li>
<li>Hintz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+%28E%29-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl+pyrophosphate+as+a+major+activator+for+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).</li>
<li>Gober, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T+cell+receptor+%CE%B3%CE%B4+cells+recognize+endogenous+mevalonate+metabolites+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells.</a> J Exp Med. 197, 163-168 (2003).</li>
<li>Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+of+gammadelta+T+cells+in+tumor+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology.</a> Cancer Res. 67, 5-8 (2007).</li>
<li>Roelofs, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+monocytes+are+responsible+for+gammadelta+T+cell+activation+induced+by+zoledronic+acid+through+accumulation+of+IPP%2FDMAPP%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP.</a> Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).</li>
<li>Dieli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+%CE%B3%CE%B4+T-lymphocyte+effector+functions+by+bisphosphonate+zoledronic+acid+in+cancer+patients+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo.</a> Blood. 102, 2310-2311 (2003).</li>
<li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronate+facilitates+large-scale+ex+vivo+expansion+of+functional+%CE%B3%CE%B4+T+cells+from+cancer+patients+for+use+in+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy.</a> Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).</li>
<li>Espinosa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+and+biological+activity+of+bromohydrin+pyrophosphate%2C+a+potent+stimulator+of+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells.</a> J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).</li>
<li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+profile+and+anti-tumor+effects+of+adoptive+immunotherapy+using+%CE%B3%CE%B4+T+cells+against+advanced+renal+cell+carcinoma%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study.</a> Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).</li>
<li>Murali-Krishna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+antigen-specific+CD8+T+cells%3A+a+reevaluation+of+bystander+activation+during+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection.</a> Immunity. 8, 177-187 (1998).</li>
<li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+culture+medium+on+the+expansion+of+T+cells+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy.</a> Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).</li>
<li>Abe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunological+evaluation+of+zoledronate-activated+V%CE%B39+%CE%B3%CE%B4T-cell-based+immunotherapy+for+patients+with+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma.</a> Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).</li>
<li>Nakajima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+study+of+adoptive+immunotherapy+for+recurrent+non-small-cell+lung+cancer+patients+with+autologous+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan yöntem PBMC γδ T hücrelerinin verimli genişleme sağlar. γδ T hücrelerinin etkinleştirilmesi ve geliştirilmesi zoledronate ve IL-2 sitokin üretim ve sitotoksisiteye yansıyan tam efektör fonksiyonları, geliştirmek. Bildirilmiştir sentetik phosphoantigens bromohydrin pirofosfat (BrHPP) ve 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfat (2M3B1PP) γδ T hücreleri genişletmek, ancak ticari olarak mevcut değildir. Buna karşılık, zoledronate zaten Zometa gibi klinik uygulamalar için lisanslıdır. Bu nedenle, güvenilir reaktif, kola...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Zometa </td><td> Novartis Pharma K. K </td><td></td><td> zoledronate </td></tr><tr><td> PROLEUKIN </td><td> Novartis İlaç </td><td></td><td> rekombinan insan IL-2 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT Hücre Hazırlık Tüp Sodyum Heparin </td><td> BD </td><td> 362753 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td><td></td></tr><tr><td> ALyS203-orta </td><td> Hücre Bilim ve Teknoloji Enstitüsü </td><td> 0301-7 </td><td></td></tr><tr><td> OpTmizer </td><td> Invitrogen </td><td> 0080022SA </td><td></td></tr><tr><td> brefeldin A </td><td> Sigma </td><td> B5936-200UL </td><td></td></tr><tr><td> phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA) </td><td> Sigma </td><td> P1585-1MG </td><td></td></tr><tr><td> ionomycin </td><td> Sigma </td><td> 13.909-1ml </td><td></td></tr><tr><td> IntraPrep </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07803 </td><td></td></tr><tr><td> insan anti-CD3-FITC veya PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07746 FITC A07749 PE/Cy5 </td><td></td></tr><tr><td> anti-insan CD4-ECD </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6604727 </td><td></td></tr><tr><td> anti-insan CD8-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6607011 </td><td></td></tr><tr><td> anti-insan CD14-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07765 </td><td></td></tr><tr><td> anti-insan CD19-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07769 </td><td></td></tr><tr><td> anti-insan CD45-ECD </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07784 </td><td></td></tr><tr><td> anti-insan CD56-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07789 </td><td></td></tr><tr><td> anti-insan TCRαβ-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A39499 </td><td></td></tr><tr><td> TCR Vγ9 anti-insan-FITC </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM1463 </td><td></td></tr><tr><td> anti-insan CD27-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6607107 </td><td></td></tr><tr><td> anti-insan CD45RA-ECD </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM2711 </td><td></td></tr><tr><td> anti-insan CD69-PE </td><td> BD </td><td> 555531 </td><td></td></tr><tr><td> anti-insan NKG2D-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A08934 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humal IFNγ-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM2717U </td><td></td></tr><tr><td> Fare IgG1 izotip kontrol PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07796 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse IgG1 izotip kontrol ECD veya PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07797 A07798 </td><td></td></tr></tbody></table>

zoledronate İnsan periferik kan genişleme γδ t hücreler

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

İnsan γδ T hücreleri tanımak ve stres kaynaklı antijenleri geniş bir yelpazede cevap, böylece doğuştan gelen geniş bir anti-tümör ve anti-enfektif aktivite gelişmekte olan 1, periferik kan γδ T hücrelerinin çoğunluğu Vγ9Vδ2 T hücre reseptör var . Bu hücreler, büyük doku uygunluk kompleksi-bağımsız bir şekilde antijeni tanıması ve güçlü sitolitik ve Th1 gibi efektör fonksiyonları gelişir. 1 Bu nedenle, γδ T hücrelerinin, kanser immünoterapi için cazip aday efektör hücreleri vardır. Vγ9Vδ2 T hücreleri gibi phosphoantigens cevap (E)-4-hidroksi-3-metil-ama-2-enyl pirofosfat (HMBPP), izoprenoid biyosentezi ile bakteriler sentezlenir; üretilen 2 ve izopentenil pirofosfat (IPP), mevalonata yolu 3 fizyolojik durumu ile ökaryot hücreler, IPP nontransformed hücre üretimi γδ T hücrelerinin aktivasyonu için yeterli değildir. Düzensizliği, tümör hücrelerinde mevalonata yolun IPP birikimi ve γδ T hücrelerinin aktivasyonu yol açar. 3 aminobisphosphonates (örneğin, pamidronat veya zoledronate) farnesil pirofosfat sentaz (SOP), mevalonata yolu IPP mansabında hareket eden enzim, hücre içi düzeylerini inhibe Çünkü γδ T hücreleri tanıma IPP ve sensitibity terapötik aminobisphosphonates artabilir. IPP birikimi nontransfomred hücreleri aminobisphosphonates ile γδ T hücreleri aktive ederek kanser için bize izin immünoterapi aminobisphosphonates farmakolojik ilgili bir konsantrasyon ile tümör hücrelerinin daha az verimlidir. PBMC aminobisphosphonates ile tedavi edildiklerinde 4 İlginçtir, IPP çünkü verimli, monositler birikir bu hücreler tarafından ilaç alımı. IPP antijen-sunan hücreler haline ve periferik kan Vγ9Vδ2 T hücreleri uyarmak birikir 5 Monositler 6 bu mekanizmalar dayanarak, biz γδ T hücre kültürleri zoledronate ve interlökin kullanarak büyük ölçekli genişlemesi için bir teknik geliştirdi -2 (IL-2). sentetik phosphoantigens bromohydrin pirofosfat (BrHPP) 8 ya da 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfat (2M3B1PP) 7 γδ T hücrelerinin genişlemesi için diğer yöntemler kullanmaktadır. 9 Tüm bu yöntemlerin eski izin evlatlık immünoterapi kullanmak için γδ T hücrelerinin çok sayıda in vivo genişlemesi. Ancak, zoledronate sadece bir FDA onaylı piyasada bulunan reaktif. CD45RA - - Zoledronate-genişletilmiş γδ T hücreleri CD27 ekran efektör bellek fenotipi ve fonksiyonu IFN-γ üretimi tahlil 7 değerlendirilebilir.

Γδ T hücreleri periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) genişletmek için bir yöntem açıklanmıştır. Hücre-kökenli γδ T hücreleri uyarılır ve zoledronate ve interlökin-2 (IL-2) ile genişletilir. Γδ T hücrelerinin büyük ölçekli genişlemesi kanser otolog hücresel immünoterapi uygulanabilir.

Zoledronate İnsan Periferik Kan Genişleme γδ T Hücreler

İnsan $\gamma\delta$ T hücreleri, stresle indüklenen çok çeşitli antijenleri tanıyabilir ve bunlara yanıt verebilir; böylece doğuştan gelen geniş spektrumlu antitümör ve ...

Bu video, zoledronat kullanılarak insan periferik kan gama delta T hücrelerinin büyük ölçekli ekspansiyonunu göstermektedir. İlk olarak, periferik kan mononükleer hücrelerini veya PBMC'leri izole etmek için tam kan, yoğunluk gradyanlı santrifüj işlemine tabi tutulur. PBMC'ler, monositlerin antijen sunan hücrelere dönüşmesini sağlamak için zoledronat ile ve gama delta T hücrelerini stimüle etmek için IL-2 ile stimüle edilir.Gamma delta T hücrelerini çoğaltmak için hücreler 14 güne kadar inkübe edilir. Akış sitometrisi ile yapılan kültür analizleri, toplanan hücrelerin çoğunluğunun CD3 pozitif Vγ9 pozitif fenotip sergilediğini göstermektedir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, Zometa'da klinik uygulamalar için halihazırda lisanslanmış olmasıdır.Bu nedenle, klinik düzeyde gama delta T-hücresi preparasyonu için güvenilir bir reaktif kolayca temin edilebilmektedir; bu durum, prosedürün Makoto Condo ve Amichi Izumi hücre kültürü ile gerçekleştirileceğini kanıtlamaktadır. Laboratuvarımdaki teknisyenler, bu prosedüre sodyum heparin antikoagülanı içeren bir BD vacutainer CPT hücre preparasyon tüpü ile iki sıvıyı birbirinden ayıran yüksek yoğunluklu sıvı ve polyester jel bariyer kullanılarak toplanan tam kandan periferik kan mononükleer hücrelerini izole ederek başlarlar. Numuneyi oda sıcaklığında, yatay salınımlı kova rotorunda 1800 ×g hızında 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası frenleme ile birlikte, tüpün içeriği beş tabakaya ayrılacaktır.En üstteki sarı katman plazmadan oluşur. Bunun altında, daha açık sarı renkli yoğunluk çözeltisinin üzerinde yer alan, periferik kan mononükleer hücrelerini ve trombositleri içeren beyazımsı bir katman bulunur. Beyaz renkli bir polyester jel katmanı, bunu granüler hücrelerin bulunduğu bölgeden ayırır; granüler hücreler, tüpün alt kısmındaki kırmızı kan hücrelerinin üzerinde yer alan gri bir katman oluşturur.İki mililitrelik bir pipet kullanarak, arayüzün üzerinde beş ila 10 milimetre plazma bırakacak şekilde plazma tabakasının bir kısmını dikkatlice toplayın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Tüpü, kültürde kullanmak üzere dört derece Celsius'ta bekletin. Ardından, arayüzdeki PBMC açısından zenginleşmiş fraksiyonu toplamak için iki mililitrelik bir pipet kullanın ve bunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.PBMC'leri yıkamak için 10 mililitre PBS ekleyin ve tüpü beş kez altüst edin. Ardından tüpü 400 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Yıkama adımlarını iki kez tekrarlayın. Daha sonra hücre pelletini beş mililitre PBS içinde yeniden süspand ettikten sonra, hücre sayısını belirlemek için bir hemositometre kullanın.Tipik olarak, bir mililitre tam kandan 1,3 × 10⁶ hücre geri kazanılır. 1 × 10⁶ hücre içeren bir PBMC fraksiyonu ayrılır ve akış sitometrisi analizi için buz üzerinde saklanır.PBMC örneğindeki gama delta T hücrelerini genişletmek için, 15 mililitrelik konik tüplerdeki hücre süspansiyonlarını oda sıcaklığında 400 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatantları atın ve hücreleri, mililitre başına 1000 IU IL-2 ve 5 µM zoledronat ile takviye edilmiş hücre kültürü ortamında, 1 × 10⁶ hücre/mL yoğunluğunda yeniden süspanse edin. Zoledronat, monositlerde farnezil pirofosfat sentazı inhibe ederek izopentenil pirofosfat birikimine ve monositlerin antijen sunan hücrelere dönüşmesine yol açar.Sıradaki pipet işlemi. 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna, 1 × 10⁶ hücre içeren bir mililitre besiyeri ekleyin; hücre yoğunluğu 0,5 × 10⁶ cm⁻² olmalıdır. Bu nedenle, daha büyük kültürler için 24 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna göre ölçeklendirme yapın.Daha önce toplanmış 100 µL otolog plazma, havuzlanmış insan AB serumu veya FBS ekleyin. Plakaları her iki ila üç günde bir nemlendirilmiş 37 °C %5 karbondioksit ortamına yerleştirin. Besiyerini, mililitrede 1000 IU insan IL-2 içeren taze serum takviyeli besiyeri ile değiştirin.Hücreler mililitre başına 0,5 ile 2 x 10⁶ hücre yoğunluğuna ulaştığında, bunları yeni kuyucuklara veya flasklara bire iki oranında bölün. Hücreleri birkaç gün boyunca gözlemleyin. Burada, sıfırıncı gündeki hücreler gösterilmektedir.Daha küçük olan hücreler lenfositlerdir. Daha büyük hücreler ise monositlerdir. Yaklaşık 24 saat sonra, monositler kuyucuğun tabanına yapışır.İki gün sonra, bazı lenfositler monositlere tutunur; üçüncü güne gelindiğinde gamma delta T hücreleri kümeler oluşturmaya başlar. Beşinci günde hücrelerin büyük kümeleri görülebilir. Buna karşılık, gamma delta T hücresi büyümesi yeterli olmadığında herhangi bir kümelenme veya agregat gözlenmeyecektir. Küme oluşumu geciktiğinde.Burada gösterildiği üzere, CD4 pozitif veya CD8 pozitif alfa beta T hücreleri veya NK hücreleri gibi diğer hücre tiplerinin büyümesi, gama delta T hücrelerinin büyümesine baskın gelir. 12. veya 14. günde, hücreleri 10 ml'lik pipetle kapsamlı bir şekilde pipetleyerek 50 ml'lik konik tüplere toplayın. Hücreler artık gama delta T hücrelerinin frekansını, fenotipini ve fonksiyonlarını belirlemek amacıyla akış sitometrisi ile analiz edilebilir.PBMC'lerin veya genişletilmiş gama delta T hücrelerinin fenotipik analizini gerçekleştirmek için, öncelikle 2x10⁵ hücre içeren 200 µL'lik örnekleri dokuz adet floresan aktive hücre ayıklama (FACS) tüpüne aktararak başlayın. 2 mL soğuk PBS ekleyin ve 400 ×g hızında beş dakika santrifüjleyin, ardından peletleri 50 µL FACS tamponunda yeniden süspande edin. Örneklere gerekli antikorların her birinden 5 µL ekleyin.Numuneleri karanlıkta, buz üzerinde 20 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her bir numuneye iki mililitre fax tamponu ekleyin ve ardından numuneleri dört derece celsius sıcaklıkta, 400 times G hızında beş dakika boyunca vorteks santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, süpernatantı dikkatlice boşaltın, hücreleri 300 microliters fax tamponu içinde yeniden süspanse edin ve vorteksleyin.Ardından, gama delta T hücrelerinin fonksiyonunu değerlendirmek için örnekleri bir akış sitometresinde analiz edin. İnterferon gama üretme kapasiteleri, hücre içi interferon gama boyaması ile analiz edilir. Gama delta T hücrelerini, 20 µg/mL felden A içeren RPMI 10 içerisinde 2 × 10⁶ hücre/mL olacak şekilde yeniden süspanse edin.Felden A, interferon gama salınımını inhibe ederek interferon gamanın hücre içinde birikmesine neden olur. Ardından, sadece 100 µL RPMI 10 veya 20 ng/mL four içeren RPMI 10, Ball 12 ate 13 asetat artı 2 µg/mL ion mycin veya Z duddy hücreleri içeren 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 µL gama delta T-hücre süspansiyonu transfer edin.Pipetle birkaç kez yukarı aşağı çekerek karıştırın. 37 °C sıcaklıktaki %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde dört saat boyunca inkübe edin. Ardından, plakayı 4 °C'de 400 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin ve pelletleri 200 µL soğuk PBS içerisinde süspanse ederek yeniden süspanse edin.Numuneleri FACS tüplerine aktarın. Ardından dört mililitre soğuk PBS ekleyin ve tüpleri 4 °C'de 400 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra, pelletleri beş mikrolitre içeren 50 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspande edin.FE konjuge anti TCRV gamma dokuz ve 2,5 µL PE SCI beş konjuge anti CD üç monoklonal antikoru, oda sıcaklığında, ışıktan korunarak 15 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından 100 µL intra prep reaktif bir ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Her tüpe 4 mL PBS ekleyin ve oda sıcaklığında 400 ×g hızda 5 dakika santrifüjleyin; santrifüjden sonra pellet'i 100 µL intra prep reaktif iki içerisinde resüsponse edin ve beş dakika inkübe edin.Oda sıcaklığında, test tüpüne beş µL PE konjuge anti interferon gama monoklonal antikoru ekleyin. Işıktan korunarak 15 dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında, her tüpe dört mL PBS ekleyin ve 400 ×g'de beş dakika santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, supernatantı aspirasyonla uzaklaştırın ve hücre peletini yeniden süspanse edin.0,5 mililitre fax tamponu içerisinde. Hücreleri akış sitometresi ile analiz ederek CD3 pozitif TCR v gamma nine pozitif hücreler üzerinde kapı seçimi yapın ve interferon gamma ekspresyonunu inceleyin. Gamma delta T hücrelerinin tipik yüzey fenotipi burada gösterildiği gibi sergilenmektedir.Sıfırıncı günde gama delta T hücreleri, CD3 ve TCRV gama dokuz ekspresyonları ile tanımlanmıştır. PBMC'lerdeki CD3 pozitif tcr RV gama dokuz pozitif gama delta T hücrelerinin yüzdesi %1,6 idi. Gama delta T hücrelerinin baskın popülasyonları CD27 pozitif, CD45 RA pozitif naive veya CD27 pozitif, CD45 RA negatif merkezi bellek fenotipleriydi. Naive veya bellek fenotiplerini belirlemek için CD27 ve CD45 RA ekspresyonları kullanılmıştır.CD 27 pozitif. CD 45. RA pozitif olanlar naiftir.CD 27 pozitif. CD 45 RA negatif olanlar merkezi bellek CD 27 negatiftir. CD 45.RA negatif olanlar efektor bellek hücreleridir. CD 27 negatif. CD 45.RA pozitif, terminal olarak farklılaşmış fenotiptir. Hücrelerin aktivasyon durumu, burada gösterildiği gibi NK G 2D veya CD 69 ile analiz edilmiştir. Gamma delta T hücreleri NK G 2D eksprese eder, ancak CD 69 eksprese etmez.14 günlük kültürden sonra, gama delta T hücrelerinin sıklığı, kültüre edilen hücrelerin %93.8'inden fazlasına yükselmiştir. Başarılı gama delta T hücresi kültürlerinde, bu hücreler CD 27 negatif CD 45 RA negatif efektör bellek fenotipi sergilemiştir. Kültüre edilen gama delta T hücreleri, nkg 2D ve CD 69 ekspresyonunu yukarı regüle etmiştir.Hücre içi interferon gama boyaması, gama delta T hücrelerinin pma CIN tedavisine veya IPP biriktiren Z dwy hücrelerine yanıt olarak interferon gama ürettiğini göstermiştir. Zoledronat tedavisinden sonra, gama delta T hücrelerinin sırasıyla %97'si PMA CIN ve %19,6'sı Z ddy hücre stimülasyonuna yanıt olarak interferon gama üretmiştir. Bu sonuçlar, zoledronatın fonksiyonel gama delta T hücrelerini etkili bir şekilde stimüle edebileceğini ve genişletebileceğini göstermektedir.Zoledronat ve IL-2 ile genişletilen gama delta T hücresi kültürünün kinetiğinde, kültüre edilen hücrelerin mutlak sayısı 12 ila 14 güne kadar eksponansiyel olarak artmıştır. Gama delta T hücrelerinin zenginleşmesi nispeten erken bir aşamada gerçekleşmiştir. Yedinci güne kadar kültüre edilen hücrelerin yaklaşık %80'i gama delta T hücreleriydi; belirtilen zaman noktalarındaki gama delta T hücrelerinin mutlak sayısı, 1,6 × 10⁴ gama delta T hücresi içeren 1 × 10⁶ PPMC'den gelişim sonrası yaklaşık 2,2 × 10⁸ gama delta T hücresi elde edilebileceğini göstermektedir.Bu teknik, kanser immünoterapi alanındaki araştırmacıların birçok farklı kanser türünde klinik uygulamaları keşfetmelerinin önünü açmaktadır. Bu kültür yöntemi, kanser hastalarında donörden alınan genişletilmiş gama delta T-hücresi transfer tedavisinin güvenliğini ve uygulanabilirliğini değerlendiren birinci faz klinik çalışmalarda kullanılmıştır.

expansion-of-human-peripheral-blood-t-cells-using-zoledronate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bryostatin 1/Ionomycin Yoluyla Tümör-reaktif T hücrelerinin ex vivo Genişleme ve Ortak Gama Zinciri Sitokinler Formülasyon

Burada genişletmek ve verimli bir şekilde arındırmak çok sayıda insan NK hücre ve kendi fonksiyonunu değerlendirmek için bir metodu tanımlar.

Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme

Öncü hücrelerin osteoklastlara farklılaşması sitokinler ve büyüme faktörleri tarafından düzenlenir. Burada, osteoklastların in vivo olarak farklılaşması için yeni bir gen transfer tekniği ve sitokinlerin osteoklastogenez üzerindeki etkilerini incelemek için bir yöntem olarak öncü hücrelerin in vitro osteoklastlara farklılaşması için hücre kültürü protokolleri açıklanmaktadır.

Bir Roman In vivo Gen Transferi Tekniği ve In vitro Hücre Tabanlı Tahliller

Bu iletişim kuralı bir vitro insan preklinik modeli osteoclastogenesis kanser hücre-Osteoklast etkileşimi taklit etmek için meme kanseri hücre hatları ile kültürlü periferik kan monosit üzerinden gelişimi anlatılmaktadır. Model kemik metastaz oluşumunu anlayışımız daha fazla ve tedavi olanakları geliştirmek için kullanılabilir.

Osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi

Burada, bir xenogeneic Graft-versus-Host hastalığı (xenoGVHD) modelinde hastalığı teşvik etmek ve puan vermek için bir protokol sunuyoruz. xenoGVHD, insan T hücrelerinin bağışıklık bastırılmasını incelemek için bir in vivo modeli sağlar. Ayrıca, immunobastırma ölçmek için bir araç olarak dijital PCR ile dokularda insan T hücrelerinin nasıl algılanmasını açıklar.

Bir Xenogeneic Murine modelinde Graft-versus-Host hastalığının indüksiyon ve skorlama ve dijital PCR kullanarak fare dokularında ınsan T hücrelerinin ölçümü

Biz bir insan periferik kan mononükleer hücre (PBMC) - çeviriimmün-onkoloji araştırma için insanlaşmış ksenogreft fare modeli dayalı açıklar. Bu protokol, I-O terapi değerlendirmesi için benzer modellerin oluşturulması ve karakterizasyonu için genel bir kılavuz görevi görebılabilir.

Çevirisel İmmüno-onkoloji (I-O) Araştırma için İnsani Periferik Kan Mononükleer Hücre (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Modeli

Greft-versus-host hastalığı allojenik kemik iliği transplantasyonu sonrası önemli bir komplikasyondur. Dendritik hücreler greft-versus-host hastalığının patogenezinde kritik bir rol oynarlar. Bu makalede, dendritik hücrelerin greft-versus-host hastalığı nın gelişimindeki rolünü ve greft-versus-lösemi etkisinin araştırılması için yeni bir kemik iliği transplantasyon platformu açıklanmaktadır.

Kemik İliği Transplantasyon Platformu Greft-versus-Host Hastalığında Dendritik Hücrelerin Rolünü Araştırmak Için

Sunulan Gama-Delta (φδ) T hücreli ilaç ürününün genişletilmesi için bir protokoldür. Lenfositler elütriasyon ile izole edilir ve zoledronik asit ve interlökin-2 ile zenginleştirilir. Alfa-beta T hücreleri klinik sınıf manyetik ayırma cihazı kullanılarak tükeniyor. δδ hücreleri K562 türevi, yapay antijen sunan hücrelerle birlikte kültürlenir ve genişletilir.

Aferezli İnsan Ürününden Gama-Delta (φδ) T Hücrelerinin Genişlemesi ve Zenginleştirilmesi

Osteoklastlar vücuttaki anahtar kemik emici hücrelerdir. Bu protokol, osteoklastların insan periferik kan monositlerinden in vitro farklılaşması için güvenilir bir yöntem tanımlamaktadır. Bu yöntem, homeostazda ve hastalıklarda osteoklast biyolojisini daha iyi anlamak için önemli bir araç olarak kullanılabilir.

Fonksiyonel Osteoklastların İnsan Periferik Kanı CD14+ Monositlerinden Farklılaşması

Burada, hasarlı bir hematopoietik ve bağışıklık sisteminin yeniden inşası için terapötik hematopoietik kök/progenitör hücreleri hasat etmek için kemik morfogenetik protein-2 yüklü jelatin iskeleler tarafından tetiklenen in vivo osteo-organoidler kurduk. Genel olarak, bu yaklaşım hücre tedavileri için umut verici bir hücre kaynağı sağlayabilir.

Terapötik Hematopoietik Kök/Progenitör Hücrelerin Toplanması için İn Vivo Osteo-organoid Yaklaşım

Öğrenin, zoledronat ve IL-2 kullanarak insan periferik kan γδ T hücrelerini büyük ölçekte genişletme yöntemini. Bu teknik, kanser immünoterapisi için otojen hücresel tedaviye uygundur ve akış sitometrisi ile doğrulanır.

Zoledronate İnsan Periferik Kan Genişleme γδ T Hücreler

Daha fazla video keşfet