Klonal Genişleme CD133 + Karaciğer Kök Hücre İzolasyonu

Bu video, kronik karaciğer hasarını takiben CD 1 33 hücre yüzey ekspresyonunu kullanarak klonal genişlemeyi incelemek için karaciğer kök hücrelerini izole etmek için bir prosedürü göstermektedir. İlk olarak, kronik karaciğer hasarı olan bir fareden karaciğer çıkarılır ve tek hücreli bir süspansiyon üretmek için sindirilir. Daha sonra kırmızı kan hücrelerini uzaklaştırmak için kırmızı kan hücreleri lizis tamponu eklenir ve çözelti, CD 45 lökositlerini çıkarmak için manyetik bir CD 45 antikoru içeren kolona uygulanır.

CD 45 tükenmiş hücreler daha sonra CD 1 33 pozitif karaciğer kök hücrelerini zenginleştirmek için sıralanır. Son olarak izole edilen CD 1 33 pozitif karaciğer kök hücreleri kültürlenir ve genişletilir. İn vitro gen ve protein ekspresyon analizi, izole edilen CD 1 33 pozitif kök hücrelerin hem hepatositlere hem de osteositlere farklılaşabildiğini göstermektedir.

Bu tekniğin, immünohistokimya teknikleri kullanılarak belirteçlerin kolokalizasyonu gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, klonal genişleme ve fonksiyonel analiz için tek hücrelerin izole edilebilmesidir. Laboratuvarımda bir yüksek lisans öğrencisi. Tüm tamponları 24 saat önceden ortamda hazırlayın ve tüm çözeltileri kullanana kadar dört santigrat derecede saklayın.

Ortam, aletler, filtreler ve tüpler steril olmalı ve steril teknikle kullanılmalıdır. Kontaminasyon riskini azaltmak için, ötenazi yapılmış bir farenin karın bölgesini %70 etanol ile silin. Steril aletler kullanarak, karın boşluğunu açın ve karaciğeri blok üzerinde açıklayın.

Safra kesesini ekilen karaciğerden çıkarın, daha sonra tüm karaciğeri laminer akış başlığında kapalı steril bir tabakta laminer akış başlığına aktarın, karaciğeri birden fazla yatay ve dikey kesimin bir kombinasyonu ile kıymak için steril bir tıraş bıçağı kullanın. Bir dakika boyunca kıyılmış karaciğeri dört parçaya bölün ve her parçayı 10 mililitre enzim sindirim solüsyonu ile kendi 15 mililitrelik tüpüne yerleştirin. Daha sonra tüpleri saniyede bir ila iki döngüye ayarlanmış bir çalkalayıcıda 45 dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin.

İnkübasyonun ardından tüpleri% 70 etanol ile silin. Daha sonra laminer bir akış başlığı altında, sindirilmiş karaciğer hamurunu 70 mikron gözenekli Filtreden pipetleyin ve daha büyük hepatositleri içeren parankimal fraksiyonu çıkarmak için akışı steril bir kapta toplayın. Filtreyi iki mililitre steril takviyeli D-M-E-M-F 12 ortamı ile durulayın.

Sindirilmiş posayı filtreden geçirmek için bir şırınga pistonunun kauçuk ucunu kullanın. Toplam hacmi yaklaşık 20 mililitre yapmak için bu işlemi beş kez tekrarlayın. Süzüntüyü iki eşit 15 mililitrelik tüpe bölün, ardından dört santigrat derecede bir dakika boyunca 50 kez G'de santrifüjleyin.

Dönüşü takiben. SUP natin'i bir numaralı snat etiketli bir tüpe aktarın ve parankimal palt'ı atın. Kök ve progenitör hücreleri içeren parankimal olmayan fraksiyonu toplamak için bir numaralı SUP natin santrifüjünü yapmak için, bir dakika boyunca 50 kez G ekleyin.

Süpernatanı, süpernatan etiketli bir tüpe aktarın. İki numara ve peleti tekrar atın. Daha sonra iki numaralı süpernatı bir dakika boyunca 50 kez G'de santrifüjleyin.

Döndürmeyi takiben, süpernatanı üç numaralı süpernatan etiketli bir tüpe aktarın ve peleti atın. Son olarak, dönüşü takiben parankimal olmayan fraksiyon elde etmek için üç numaralı son SNAT'ı sekiz dakika boyunca 180 kez G boyunca santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hemen kırmızı hücrelerin ve peletin bağlandığı protokolün bir sonraki adımına geçin. Prosedürün bu kısmı için kullanılan kırmızı hücre lizisi, tampon ve değirmen teni tamponu, bir gece önceden hazırlanmış ve ekteki yazılı belgedeki talimatlara göre dört santigrat derecede saklanmış olmalıdır.

Buz üzerindeki hücreler ve çözeltiler ile laminer bir akış başlığında çalışmak. Resus, parankimal olmayan peleti, bir x seyreltilmiş kırmızı kan hücresi lizis tamponunun bir mililitresinde yukarıdaki adımdan askıya alır ve beş mililitrelik bir tüpe aktarır. Tüpü kapatın ve beş saniye boyunca hafifçe girdap haline getirin.

Dört santigrat derece 15 dakika inkübe edin. 15 dakika geçtikten sonra ışıktan korunur. Tüpü, parçalanmış kırmızı kan hücreleri ve resüs içeren süpernatanı yaralamak için dönüşü takiben beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin.

Peletleri bir mililitre buzda, soğuk ve steril olarak askıya alın. Tampon santrifüjünü 200 kez G'yi beş dakika eritin. Döndürme işleminden sonra, süpernatanı atın ve peleti bir mililitre buz gibi soğuk ve steril olarak yeniden süspanse edin.

Milton e buffer. Daha sonra bu hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini çıkarın ve 10 mikrolitre şerit mavi ekleyin. Parankimal olmayan fraksiyondan CD 45 hematopoietik hücre tükenmesini gerçekleştirmek için bir hemo sitometre kullanarak parankimal olmayan hücreleri sayın.

Hücrelerin konsantrasyonunu 10 ila yedinci ila 10 ila sekizinci olarak ayarlayarak laminer akış başlığında başlayın. 100 mikrolitre erimiş tampondaki toplam hücreler. Tüm prosedür boyunca hücreleri ve tamponları soğuk tuttuğunuzdan emin olun.

Daha sonra, 10 milyon hücre başına 20 mikrolitre mil, herhangi bir CD 45 mikroboncuk antikoru uygulayın ve 15 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından, iki mililitre mil, herhangi bir tampon ekleyin ve beş dakika boyunca 200 kez G santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra, snat'ı çıkarın ve bir mililitrede 10 ila sekizinci hücreye kadar yeniden süspanse edin.

Milt, laminer akış başlığındaki herhangi bir tampon, bir Milt, herhangi bir LD manyetik sütunu manyetik bir tutucuya yerleştirin. Süzüntüyü yakalamak için filtrenin altına steril beş mililitrelik bir tüp yerleştirin. Sonra iki mililitre yükleyin.

Bir filtre ön yıkaması yapmak için herhangi bir tamponu eritin. Yıkama tamamlandıktan sonra hücreleri kolona yükleyin. Hücre süspansiyonu kolonun içine girdikten sonra, kolonu yıkamak için bir mililitre eriyik e tamponu ekleyin, bu yıkamayı iki kez daha gerçekleştirin.

Filtrasyon hızını artırmak için bir kolonla birlikte verilen pistonu kullanmayın. Tüm yıkamalar yapıldıktan sonra, CD 45 tükenmiş parankimal olmayan hücrelerin toplanan süzüntüsünü beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin. Sütunu, tutulan bir cd 45 pozitif hücreyle atın.

Bir sonraki akış sitometrisi, CD 1 33 pozitif hücreleri izole etmek, Milt'teki hücreleri, herhangi bir tamponu, 100 mikrolitre başına 10 ila yedi hücreyi, 100 mikrolitreyi ilk tüpe üç tüpe izole etmek için gerçekleştirilir. İkinci tüpe iki mikrolitre CD 1 33 PE konjuge antikor ekleyin. Kontrol olarak IgG PE konjuge antikoru ekleyin.

Üçüncü hücre tüpü, lekesiz kontrol görevi görecek, inkübasyonu takiben karanlıkta 15 dakika boyunca dört santigrat derece inkübe edilecek, iki mililitre boyama tampon santrifüjünde beş dakika boyunca 200 kez G yeniden süspanse edilecektir. Süpernatanı atın ve peleti bir mililitre Milton e tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, akış sitometresinde, CD 1 33 pozitif hücre popülasyonunun optimize edilmiş geçitlenmesi için sıralama parametrelerini ayarlamak için boyanmamış hücreler ve IGPE boyama hücreleri kullanın.

FICO ERYN veya RPE'miz genellikle 488 nanometre yayan bir lazere sahip herhangi bir akış sitometresi ile kullanılabilir. Son olarak, CD 1 33 pozitif yürüyüş kullanarak CD 1 33 pozitif hücre popülasyonunu izole edin ve hücreleri steril filtrelenmiş oval hücre ortamında toplayın. Hücreler artık kültürlenebilir ve klonal İzolasyon gerçekleştirilebilir, ardından potansiyel durumu değerlendirmek için gerçek zamanlı PCR CD 1 33 yapılabilir.

Pozitif karaciğer kök hücreleri, burada görüldüğü gibi bu videoda anlatıldığı gibi vahşi tip ve MAT one A nakavt farelerden izole edildi. CD 1 33 pozitif hücreler, kronik karaciğer hasarının bir modeli olan genetik nakavt MAT bir A eksi eksi'de vahşi tip farelerden yaralanmamış karaciğerden türetilen yüksek oranda zenginleştirilmiş CD 45 tükenmiş parankimal olmayan kontrol fraksiyonunun %0.4'ünü oluşturur. CD 1 33 pozitif popülasyon, aynı yüksek oranda zenginleştirilmiş fraksiyonda on kat veya daha fazla genişler.

Tasnif edildikten sonra hücreler kültüre edildi ve klonlar genişletildi. Gösterilen. Burada, laminin kaplı 96 oyuklu plakalar üzerinde genişletilmiş tek CD 1 33 pozitif hücreden türetilen dört koloninin faz kontrast görüntüleri verilmiştir. Bu hücreler izolasyondan yedi gün sonradır ve kolonilerin yaklaşık 25 hücre olduğu yedinci günde küçük kompakt epitel hücre kolonileri gösterir.

Hücrelerden RNA izole edildi ve bu R-T-P-C-R deneylerinde görülebileceği gibi kolanjio bölge belirteci CK 19'un gen ekspresyonu analiz edildi. Gen ekspresyonu, hepatosit marker albümin ve kolanjiyo bölge markörü CK 19'un ekspresyonunu gösterir, CD 1 33 pozitif hücrelerin potansiyel durumu ile doğrular, CD 1 33 pozitif hücrelerin potansiyel durumu ile doğrular, ilk ilk tek hücre izolasyonu ve genişlemesi in vitro bir kez 10 mat olandan altı hücreye, Bir eksi eksi model, immün yetmezliği olan çıplak farelere deri altından enjekte edilir. Oklar, hücrelerin enjekte edilmesinden dört hafta sonra büyüyen tümörleri gösterir.

CD 1: CCL dört veya %0.1 DDC diyeti gibi toksine bağlı kronik karaciğer hasarından 33 pozitif hücre tümör oluşturmaz. Tümör oluşumu in vivo, kök hücre popülasyonu içindeki malign potansiyeli veya kanser kök hücre fenotipini tanımlamak için kullanılır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa sekiz saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü takiben, EPAM veya diğer gerçekler gibi ek olgu belirteçleri ekleyin. Karaciğer progenitör hücre popülasyonlarının yüzey belirteçlerini rafine etmek gibi ek soruları yanıtlamak için yan popülasyon flx gibi teknikler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, akış sitometrisi kullanarak karaciğer sapı ve progenitör hücrelerin nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Hayvan dokusu ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman eldiven giymek ve uygun laboratuvar teknikleri gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.