Drosophila Medulla Katmanları ve Sütunları Boyunca Dendritik Morfolojinin Analizi

Antifade montaj ortamında gliserol ile temizlenmiş bir Drosophila beyni ile başlayın.

Beyin, sinaptik bağlantıları organize eden katmanlar halinde düzenlenmiş medulla nöronları ve nöral devreleri koordine eden sütunları içerir.

Bu nöronların birkaçı, kırmızı floresan fotoreseptör aksonları ile kontrast oluşturan yeşil floresan işaretleyicilerle etiketlenmiştir.

Beynin ventral tarafını yukarı kaldırın. Beyin örneğinin ezilmesini önlemek için yanlarına küçük kil yamaları olan bir lamel yerleştirin.

Mikroskop altında, yeşil etiketli nöronu içeren yatay görünüm görüntü yığınını elde edin.

Lameli çıkarın ve beyni ön tarafı yukarı bakacak şekilde yeniden konumlandırın.

Aynı nöronun önden görünümünün bir görüntü yığınını yakalayın.

Yazılımı kullanarak, bu görüntüleri birleştirin, fotoreseptör kanalını çıkarın ve nöronun 3D görüntüsünü görselleştirin.

Medulla katmanları ve sütunları boyunca dendritik organizasyonu haritalamak için aksonu ve ardından dendritleri izleyin, her dalı sonlandırılana kadar takip edin.

Beyni yatay yönde monte etmek için, gliserol ile temizlenmiş bir beyni, mikroskop lamı üzerinde merkezi olarak biriktirilen 20 mikrolitrelik bir solma önleyici montaj ortamına aktarın. Ardından, bir lamel üzerine, lamellerin beyni ezmesini önlemek için dört köşeye küçük kil parçaları ekleyin.

Şimdi, diseksiyon mikroskobu altında, beyinleri ventral yukarı pozisyonda konumlandırın. Beyin örneğinin yönünü belirlemek için beynin dışbükey dorsal yüzeyini bir dönüm noktası olarak kullanın. Bu, nöronun yatay bir görünümünü sağlayacaktır. Ardından lamel takın.

İdeal olarak GaAsP dedektörleri ile donatılmış konfokal bir mikroskop kullanarak. Yüksek sayısal diyafram açıklığı objektifi ve 2,5 dijital yakınlaştırma ile yatay görünüm görüntü yığınını elde edin. En az 180 optik bölüm edinin, 512 kare piksele ve 0,2 mikron adım boyutuna sahip olun.

İlk görüntü yığınını aldıktan sonra, lamel slayttan çıkarın ve beyni önden bir görünüm sağlayan ön yukarı pozisyonda yeniden konumlandırın. Daha sonra, aynı tekniği kullanarak, yatay görünümde görüntülenen aynı nöronların önden görünümünün yeni bir görüntü yığınını oluşturun. Medulla nöropiline göre ilgilenilen nöronun konumunu da kaydettiğinizden emin olun.

Aynı nöronları tanımlamak, daha düşük büyütme altında mümkündür. Bununla birlikte, doku derin olduğu için sinyal kaybolursa, sadece beynin ventral yarısını görüntüleyin.

Bu prosedürün amacı, nöritleri izlemek ve kayıt için referans noktaları atamaktır. İlk olarak, yeniden birleştirilen görüntü dosyasını açın. Ardından Düzenle'ye, ardından Ekran Ayarını Göster'e gidin ve kırmızı olan fotoreseptör kanalını kapatın.

Ardından, görüntüyü aşma modunda görselleştirin. Bilgisayarda stereograf sistemi varsa, stereoyu açın ve 3D görüntüleri görselleştirmek için Dörtlü Tampon modunu kullanın. Yeni filamentler ekleyin. Surpass'a ve ardından Filamentler'e gidin. Ve "Otomatik oluşturmayı atla, manuel olarak düzenle" etiketli sekmeye tıklayın. Ardından Çiz sekmesine tıklayın ve Otomatik Derinlik'i seçin.

Ardından, Ayarlar'ı seçin. Geçiş yapın Satır seçeneğini belirleyin ve daha iyi görselleştirme için uygun piksel numarasını girin. Ardından Dendritleri Göster, Başlangıç Noktası ve Dallanma Noktası'nı değiştirin ve Oluşturma Kalitesini %100'e ayarlayın. Şimdi Çiz sekmesini seçin ve nöritleri izlemeye başlayın. Akson ile başlayın, ardından dendritlere geçin. Transmedulla nöronlarının akson ve dendritlerinin ayırt edilmesi kolay olmalıdır.

Nöritleri izledikten sonra, Ayarlar'a geri dönün ve hem Başlangıç Noktası hem de Dallanma Noktası arasında geçiş yapın. Ardından Aş'a ve ardından Dışa Aktar'a gidin. Nesneleri seçin ve filamenti bir Inventor dosyası olarak kaydedin.