Hücre Bazlı Nörotransmitter Floresan Mühendislik Raportörleri Kullanılarak Nörotransmitter Salınımının Görüntülenmesi

Beyin görselleştirmesini sağlamak için ince bir kafatası tabakası içeren bir kafatası penceresine sahip bir fare alın.

Baş hareketi, takılı bir kafa çubuğu kullanılarak sınırlandırılır.

Korteks, nörotransmitter salınımının gerçek zamanlı olarak tespit edilmesini sağlayan raportör hücreler olan hücre bazlı nörotransmitter floresan mühendislik raportörleri veya CNiFER'ler ile önceden enjekte edilir.

CNiFER'ler, bir G-proteinine bağlı nörotransmitter reseptörü ve donör ve alıcı floroforlara kaynaşmış bir kalsiyum bağlama alanından oluşan bir sitoplazmik kalsiyum detektörünü eksprese eder.

İki fotonlu bir mikroskop kullanarak, donör floresan emisyonuna neden olmak için dedektörü uyarın ve CNiFER görselleştirmesini etkinleştirin.

Kortekse ulaşan nöronal aktivite, nörotransmitter salınımına neden olur.

Bu nörotransmiterler CNiFER reseptörlerine bağlanır ve endoplazmik retikulumdan kalsiyum salınımını indükleyen sinyal yollarını aktive eder.

Artan sitoplazmik kalsiyum, dedektöre bağlanarak floroforları yakınlaştıran konformasyonel bir değişikliğe neden olur.

Verici, nörotransmitter salınımını gösteren alıcı floresan emisyonunu uyarmak için alıcıya enerji aktarır.

Görüntüleme platformunu, iki fotonlu bir görüntüleme mikroskobunda 10x suya daldırma objektifinin altına başı kapalı fare ile yerleştirin. ECFP'yi ölçmek için 460 nanometre ila 500 nanometre ve Citron'u ölçmek için 520 nanometre ila 560 nanometre arasında değişen bant geçiren filtrelere ve 505 nanometrede dikroik aynaya sahip perde görüntüleme için filtre küpünü yerleştirin.

Ardından, inceltilmiş kafatası penceresini içeren kuyuya ACSF'yi ekleyin ve 10x suya daldırma hedefini ACSF'ye indirin. cNIFER'leri bulmak için cıva lambası ve GFP filtre küpü ile birlikte göz merceğini kullanın. Şimdi, 40x suya daldırma hedefine geçin.

Ardından, iki fotonlu görüntüleme için uygun ışık yolunu seçin. Yakın kızılötesi femtosaniye darbeli lazeri açın. 820 nanometre dalga boyunu ve %5 ila %15 arasında bir güç ayarı seçin. PMT1 ve PMT2 voltajını, PMT'ye bağlı olarak tipik olarak 500 ila 1000 volt arasında bir alt maksimum değere ayarlayın.

Ardından kazancı her kanal için 1'e ve hedef için Z konumunu 0'a ayarlayın. Hedefi kortikal yüzeyden yaklaşık 100 ila 200 mikrometre uzağa indirin ve x, y taramasını başlatın. cNIFER'in floresansının sinyal-gürültü oranını optimize etmek için her kanal için lazer güç kazancını ve PMT voltajını ayarlayın.

Ardından, görüntülemeyi cNIFERs hücrelerini ve bir arka plan bölgesini içeren bir bölgeyle sınırlamak için yazılımı kullanın. Uygun bir sinyal-gürültü oranı için iki kişilik Kalman çizgisinin ortalamasını seçin ve piksel başına 4 mikrosaniyede 0,3 ila 1 hertz arasında bir tarama hızı kullanın. Bundan sonra, cNIFER hücrelerinin etrafına, düzlem başına yaklaşık üç ila dört hücreyi çevreleyen bir ROI çizin.

ROI ortalama yoğunluklarının gerçek zamanlı analizini ayarlayın. Ardından, zaman içinde cNIFER floresansını izlemek için edinime başlayın ve perdeyi izlerken elektriksel stimülasyona veya davranışsal bir deneye başlayın.