Rekombinant Miyelin Oligodendrosit Glikoproteinlerinin İzolasyonu ve Saflaştırılması

MOGtag, Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit çalışmaları için çözündürme ve saflaştırma etiketleriyle kaynaşmış rekombinant bir Miyelin Oligodendrosit Glikoproteinidir.

MOGtag'ı izole etmek için, MOGtag'ı eksprese eden bakteri hücrelerini bir lizis tamponunda askıya alın ve inkübe edin.

Tampondaki enzimler ve deterjanlar zar lipitlerini bozar ve hücre duvarını bozar.

Hücreleri daha fazla parçalamak için sonikat, MOGtag içeren çözünmeyen inklüzyon cisimlerini serbest bırakır.

İnklüzyon cisimciklerini peletlemek için santrifüjleyin. Süpernatanı atın, peleti tamponda yeniden süspanse edin ve inkübe edin.

Guanidin hidroklorür ekleyin, ardından MOGtag'ı çözündürmek için inkübe edin.

Çözünür proteinleri yüklü bir nikel reçinesi üzerine aktarın, karıştırın ve MOGtag'ın nikel iyonlarına bağlanmasına izin vermek için çalkalama ile inkübe edin.

Bağlı MOGtag'ı peletlemek için santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın, peleti bir elüsyon tamponunda yeniden süspanse edin ve çalkalayarak inkübe edin.

Elüsyon tamponundaki imidazol, reçineden MOGtag'ı serbest bırakır.

Tekrar santrifüjleyin, saflaştırılmış MOGtag içeren süpernatanı toplayın ve daha fazla analiz için saklayın.

Kültürleri yüksek hızlı santrifüjleme ile uyumlu 250 mililitrelik şişeler arasında eşit olarak dağıtın ve şişeleri bu noktadan itibaren buz üzerinde tutun. Bakteri hücrelerini 22.000 * g'da 4 santigrat derecede 15 dakika boyunca peletleyin. Tüm bakteri peletlerini toplam 30 mililitre lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve birleştirin. Bu hacmi, yüksek hızlı santrifüjleme yapabilen yuvarlak tabanlı 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Bu tüpü 30 dakika boyunca 30 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. Kuluçka süresi boyunca, hücreleri yeniden askıya almak için tüpü iki kez sallayın. İnkübasyonun ardından, tüpü buz üzerine aktarın ve çözeltiyi 20 kilohertz ve% 70 genlikte, üç saniye boyunca yanıp sönerek ve 5 darbe için üç saniye boyunca kapalı olarak sonikleştirin. Çözeltiyi toplam altı tur beş darbe için sonikasyon yapın ve çözeltinin turlar arasında buz üzerinde soğumasına izin verin.

Daha sonra, çözeltiyi 4 santigrat derecede 15 dakika boyunca 24.000 * g'da santrifüjleyin, daha sonra peleti 30 mililitre tampon A'da yeniden süspanse edin ve çözeltiyi üç saat boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, çözeltiye 17.2 gram guanidin-HCl ekleyin. MOG etiket proteinini çözündürmek için numuneyi bir saat buz üzerinde inkübe edin. MOG etiket proteinini saflaştırmak için, çözündürülmüş proteinin tüm hacmini nikel reçinesi içeren ilk tüpe aktarın. Karıştırdıktan sonra, tüpü bir saat boyunca 4 santigrat derecede bir külbütöre yatay olarak yerleştirin.

Tüpü 4.500 * g'da 4 santigrat derecede sekiz dakika santrifüjledikten sonra, süpernatanı ikinci nikel reçine tüpüne aktarın ve daha önce olduğu gibi inkübe edin. Bu arada, ilk tüpteki nikel reçinesini 40 mililitre elüsyon tamponunda yeniden süspanse edin ve tüpü, daha önce olduğu gibi santrifüjlemeden önce beş dakika boyunca 4 santigrat derecede bir külbütör üzerine yatay olarak yerleştirin. Ayrıştırılmış MOG etiket proteinini içeren süpernatanı, saflaştırılmış MOG etiket proteini etiketli 250 mililitrelik bir şişeye aktarın. Bu şişeyi 4 santigrat derecede tutun.