Bilinçli Mesnetlenmemiş Fare hiperinsülinemik öglisemik Kelepçeleri

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bilinçli ve strese girmemiş farelerde, farelere dokunmadan tüm vücut ve dokuya özgü insülin etkisini değerlendirmektir. Bu işlem, infüzyonlar için juguler vene ve kan örnekleri almak için karotis arterine cerrahi olarak kateter yerleştirilerek gerçekleştirilir. Beş ila yedi günlük bir iyileşme döneminden sonra, beş saat boyunca aç bırakılan farelere fizyolojik hiperinsülinemi sağlamak amacıyla insülin infüzyonu yapılır.

Ardından arteriyel kateterden glukoz seviyeleri ölçülür ve glukoz infüzyon hızı ayarlanarak U glisemi korunur. Bu deney, U glisemi düzeyini korumak için gerekli olan glukoz infüzyon hızı ile insülin etkisi arasındaki doğrudan ilişkiye dayanarak tüm vücut insülin duyarlılığındaki farkların ölçülmesine olanak tanır. Bu tekniğin, kuyruk kesme gibi mevcut kan alma yöntemlerine göre temel avantajı, cerrahi olarak implante edilen arteriyel kateterin fareye vasküler erişim sağlayarak fareyi tutmak zorunda kalmadan kan örnekleri almamıza imkan vermesidir.

Bu sayede, stres altında olmayan ve kısıtlanmamış farelerle bu deneyleri gerçekleştirmemiz mümkün olur. Arter kateteri, PE 10 tüpünün eğimli bir parçasının, PE 10'un selden 0,9 cm dışarı çıkacak şekilde altı santimetrelik bir astik tüp parçasına yerleştirilmesiyle hazırlanır. Venöz kateter ise yakalı altı santimetrelik bir SEL tüp parçasıdır.

Masa, üç santimetrelik PE 20 parçalarının, yaklaşık 120 derecelik bir açıyla, iki adet 1,3 santimetrelik 25 gauge paslanmaz çelik konnektöre yerleştirilmesiyle oluşturulur. Bunlar, burada gösterildiği gibi bir miktar medikal silikon yapıştırıcıya yerleştirilir. Kateter implantasyonuna başlamak için, steril teknik kullanarak anestezize edilmiş bir fareyi temiz bir çalışma yüzeyine yerleştirin. Orta hattın beş milimetre sağına bir insizyon yapın.

Sağ juguler veni izole edin. Sefalik ucu ipek sütur ile dikkatlice bağlayın ve kodal uca başka bir sütur parçasıyla gevşek bir düğüm atın. Ardından, yaylı makasla sefalik ligatürün hemen altından kesin ve kateteri tutucu boncuğa kadar yerleştirin.

Boncuğun arkasına bir sütür bağlayın ve kateterin serbest ucunu bir örnekleme şırıngasına bağlayarak kateterin örnekleme yaptığını doğrulayın. Arteriyel kateteri yerleştirmek için, sternumun beş milimetre soluna ve ilk insizyonun kefealik kısmına küçük bir insizyon yapın. Sol karotis arterini izole edin, ardından kefealik kısmı ligatörleyin.

İpek sütür ile bitirin ve gevşek bir düğüm atın. Açığa çıkarılan damarın kranial ucuna başka bir sütür parçası yerleştirin. Ardından, damarın kaudal ucunu klempleyin.

Ve ligatlı ucun hemen altından yaylı makasla kesin. Kateteri klempe kadar dikkatlice yerleştirin. Klembi dikkatle serbest bırakın ve kateteri Astic P eklemine kadar ilerletin.

Bağlama iplerini katetere sıkıca bağlayın ve kateterin serbest ucunu bir örnekleme şırıngasına bağlayarak kateterin örnekleme yaptığını doğrulayın. Ardından, hayvanı ters çevirin ve kürek kemikleri arasında küçük bir insizyon yapın; 14 gauge bir iğneyi, öndeki insizyonlardan sırttaki bu insizyona doğru deri altından tünel açarak ilerletin. Kateterleri, farenin sırt kısmından dışarı çıkarmak için iğne aracılığıyla geçirin.

Örnekleme erişimi veya masa için arteryel ve venöz kateterleri fare antenindeki uygun konnektörlere bağlayın. Ardından, masayı kürek kemikleri arasındaki insizyona yerleştirin. Her iki insizyonu da naylon sütür ile kapatın.

Her iki kateterin açık olduğunu doğrulayın. Fareyi iyileşme için sıcak ve temiz bir kafese yerleştirin ve insülin klempten önce farenin en az beş gün boyunca iyileşmesine izin verin. Farelerde hiperinsülinemik öglisemik klembin uygulanmasındaki en zor adım, öglisemiyi korumaya çalışmaktır.

Farelerin metabolizmaları çok hızlıdır ve glukoz seviyeleri deney süresince önemli ölçüde değişebilir. Bu durum, bir farenin glukoz seviyelerinin deney boyunca nasıl değişeceğine dair bir sezgi geliştirmek ve ardından glisemiyi sabit tutmak için glukoz infüzyon hızını nasıl ayarlayacağınızı öğrenmek adına biraz pratik yapmayı gerektirir. Standart bir klembin kurulumu burada gösterilmiştir.

Üç adet infuse eight, glukoz, insülin ve yıkanmış eritrositler, bir döner ekleme (swivel) düzeneğine bağlı dört yollu bir konnektöre takılır ve farenin üzerine asılır. Döner ekleme düzeneğinin infüzyon portu venöz katetere bağlanır. Fareyi bağlamadan önce, tüm infuse eight hatlarını salin ile doldurun.

Ardından, örnekleme hattını heparinli salinle doldurun. Temizleme şırıngasını uzaklaştırdıktan sonra, swivel'in üst kısmına heparinli salin içeren bir şırınga bağlı bırakın. Klemplleme işleminden beş ila altı saat önce fareleri açlığa bırakmaya başlayın.

Açlığın üçüncü saatinde çalışmaya başlayın, fareyi tartın ve venöz ile arteryel kateterleri sırasıyla infüzyon ve örnekleme hatlarına bağlayın. Klembin başlamasından 15 dakika önce, el tipi bir glukometreye boş bir glukoz şeridi yerleştirin. Ardından, hattaki tüm salini uzaklaştırmak için temizleme şırıngasıyla yaklaşık 50 µL kan çekin ve temizleme şırıngasını ayırın.

Glukoz şeridini tüpün ucunda oluşan kan damlasına değdirerek kan glukoz seviyesini ölçün. Ardından, örnekleme hattına küt uçlu iğneye sahip bir şırınga yerleştirin ve 50 µL kan çekin. Kanı EDTA kaplı bir tüpe aktarın ve bazal hormon ve metabolit ölçümleri için plazmayı toplamak amacıyla tüpü santrifüjleyin.

Bu aşamada, temizleme şırıngasını tekrar yerleştirin ve pistonu geri çekin. Hava kabarcıklarını gidermek için, başlangıçta çekilen 50 µL kanı tekrar enjekte edin. Glukometreden okunan kan glukoz değerini not edin.

10 dakika sonra, kan glukoz ölçümünü tekrarlamak için glukometre ve temizleme şırıngasını kullanın ve ardından başka bir plazma örneği elde etmek için 50 µL daha kan çekin. İkinci bazal ölçümler alındıktan sonra; glukoz, insülin ve salinle yıkanmış eritrosit infüzyon hatlarını dört yollu konnektöre kadar doldurun. Dört yollu konnektörü, döner infüzyon portuna bağlı olan tüplere bağlayın.

Salin ile yıkanmış eritrositlerin infüzyonuyla başlayın. İnfüzyon hızını, çalışma süresi boyunca örneklenen toplam kan hacmini karşılayacak şekilde ayarlayın. Eritrosit infüzyonu fareye ulaştığında, insülin ve glikoz infüzyonlarına başlayın.

Bu, sıfırıncı dakikadır. İnsülin, önceden belirlenmiş sabit bir hızda infüze edilir. Başlangıç glikoz infüzyon hızı, bazal kan glikoz seviyelerine ve önceki deneyimlere dayanarak tahmin edilir.

Sonraki iki saat boyunca, glukometre ile kan glikoz değerlerini ölçün ve hedef glisemiyi korumak için glikoz infüzyon hızını ayarlayın. 10 dakikalık aralıklarla yeni glikoz değerlerini ve glikoz infüzyon hızlarını kaydedin; 100. ve 120. dakikalarda, plazma insülinin ve diğer hormonların veya metabolitlerin ölçümü için ek kan toplayın. Burada, klempleme prosedürü boyunca glikoz seviyelerinin zaman seyri görülmektedir ve bu, hem standart diyetle beslenen hem de yüksek yağlı diyetle beslenen farelerde gliseminin klempleme boyunca ne kadar iyi korunduğunu göstermektedir. Glikoz infüzyon hızının zaman seyri, glisemiyi korumak için gerekli hızın yüksek yağlı diyetle beslenen grupta anlamlı derecede daha düşük olduğunu göstermekte olup, bu durum tüm vücut insülin etkisinde bozulmaya işaret etmektedir.

Hem açlık hem de klemps insulin seviyeleri yüksek yağlı beslenen grupta daha yüksektir, bu da insülin dirençli bir fenotipin varlığını daha da desteklemektedir. Bu farelerde, endojen glukoz görünme hızını tahmin etmek için tritiyumlu glukoz kullanılır. Endo a, hepatik glukoz üretiminin bir göstergesiyken, kontrol farelerinde insülin endo A'yı tamamen baskılar.

Yüksek yağlı diyetle beslenen farelerde baskılanma bozulmuştur. Benzer şekilde, tüm vücut glikoz yok olma hızını tahmin etmek için TRID glikoz kullanılır. İnsülinin RD'yi stimüle etme yeteneği, yüksek yağlı diyetle beslenen farelerde zayıflamıştır.

Karbon 14 içeren 2-deoksiglukoz, dokuya özgü glukoz alımının bir ölçüsü olan glukoz metabolik indeksi RG'yi değerlendirmek için kullanılır. Bu örnekte görüldüğü üzere, yüksek yağlı diyetle beslenen farelerde insülinle stimüle edilen iskelet kası glukoz alımı bozulmuştur. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, arteriyel ve venöz kateterleri yerleştirmek için gereken mikrocerrahi konusunda zorluk yaşayacaklardır.

Cerrahi işlem oldukça uzmanlaşmış beceriler gerektirmektedir ve hiperinsülinemik öglisemik klempe yönelik cerrahide oldukça mahir hale gelmek için birkaç ay boyunca sürekli uygulama yapılması gereklidir; buradaki zorluk, metabolizması çok yüksek olan bir hayvan modelinde öglisemi durumunu korumaya çalışmaktır.