Kültürlü Astrositlerde Yükün Hücre İçi Taşınımının Görselleştirilmesi

Bir kültür kabı içindeki bir lamel üzerinde fare birincil astrositlerinin yapışık bir kültürüyle başlayın.

Astrositlere girmek için sağlam hücre zarlarını geçen bir floresan asidotropik prob ile inkübe edin.

Prob, asidik endolizozomal veziküllerin içinde seçici olarak birikir ve taşınmalarını izlemek için vezikülleri floresan olarak etiketler.

Fazla probu çıkarmak için yıkayın ve taze ortam ekleyin.

Kültürü konfokal bir mikroskop altına yerleştirin ve hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirmek için tek bir hücreye odaklanın.

, sitozol ve astrositik süreçler

içinde dağılmış floresan puncta olarak görselleştirin

Üç boyutlu hücre hacmi boyunca kargoyu görselleştirmek için Z ekseni boyunca birden fazla odak düzlemi yakalayın.

Astrositler içinde çeşitli derinliklerde hücre içi kargo taşınmasını izlemek için belirli aralıklarla görüntüleme yapın.

Sabit kargo, hücre çevresine doğru hareket eden kargo ve çekirdeğe doğru hareket eden kargo arasında ayrım yapmak için kargo hareketini analiz edin.

Görüntülemeden 30 dakika önce, uygun bir lizozomal etiketleme probunu 200 mikrolitre astrosit kültür ortamında 1 mikromolar çalışma konsantrasyonuna seyreltin ve astrositleri prob ile 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca etiketleyin. Daha sonra hücreleri bir kez ılık astrosit kültür ortamı ile yıkayın ve yıkamayı görüntüleme ortamı ile değiştirin.

Prob etiketlemesinden hemen sonra, astrosit kültür kabını mikroskop tablasındaki uygun adaptöre yerleştirin. Ve epifloresan ışığı kullanarak, floresan proteinleri veya probu ifade eden hücreleri bulun. Seçilen hücreleri görselleştirmek için floresan örnek aydınlatmasını ayarlamak için dijital kamerayı kullanın ve odağı ayarlayın ve tek bir hücreye yakınlaştırın.

Ardından, 300 ile 500 saniye arasında değişen zaman aralıkları için her iki saniyede bir kare frekansında tek bir C-yığını zaman atlamalı seri elde etmek için Yakınlaştır ve kesin odak işlevlerini kullanın. Hızlandırılmış görüntüleri Avi veya TIFF yığın dosyaları olarak kaydedin ve dışa aktarın.