$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Konfokal bir mikroskop yazılımıyla başlayın ve görüntü elde etme parametrelerini ayarlayın.
Ardından, bir cam slayt üzerine monte edilmiş bir fare beyni bölümünü alın. Bu bölüm kan-beyin bariyeri bileşenlerini hedef alan antikorlarla boyanır.
Kan-beyin bariyeri, homeostazı korumak için kan dolaşımı ve beyin arasında seçici bir hücresel arayüzdür.
Çözünürlüğü optimize etmek ve ışık kırılmasını en aza indirmek için lamel üzerine istenen kırılma indisine sahip bir damla daldırma yağı uygulayın.
Slaytı mikroskop tablasına yerleştirin ve numuneyi görselleştirmek için epifloresan lambayı kullanın.
Uygun filtreleri kullanarak, DAPI ile boyanmış çekirdekleri bulun ve görüntüleme için kılcal segmenti tanımlayın.
Canlı taramayı başlatın ve yüksek kaliteli görüntüler yakalamak için her floresan kanalının parametrelerini ayarlayın.
Son olarak, kan-beyin bariyerinin üç boyutlu bir görüntüsünü oluşturmak için Z-yığını alımının başlangıç ve bitiş noktalarını tanımlayın.
Yazılımın mikroskobu kontrol eden Edinme menüsünde, görüntü alma parametrelerini ayarlayın. Görüntü boyutu açılır menüsünde 1.024 x 1.024 piksel arasında bir değer seçin. Yakınlaştır menüsünün değerini ayarlayarak piksel boyutunu 200 ile 300 nanometre arasında bir değere değiştirin.
Edinme Hızı açılır menüsünde 400 hertz değerini seçin. Ardından, Sistem Ayarları menüsünde piksel derinliğini seçin ve değeri 12 bit olarak değiştirin. Ardından, mikroskop yazılımında, Edinme sekmesinde, sıralı çerçeve alma seçeneğini açın. İğne Deliği menüsündeki değeri değiştirerek optik kesit kalınlığını her kanal için 0,75 ile 1 mikrometre arasında bir değere ayarlayın.
Lamel ve objektifin kırılma indisine uyacak şekilde beyin bölümü ile birlikte, kırılma indisi 1.52 olan bir damla daldırma yağı ekleyin. Ardından, numuneyi mikroskoba yerleştirin ve mikroskop dürbününü kullanarak numuneyi görselleştirmek için epifloresan lambayı açın. Ardından, canlı tarama modunu başlatmak için düğmeye basın. Tarama sırasında, görüntülerin dinamik aralığını en üst düzeye çıkarmak ve piksel doygunluğunu önlemek için her kanal için kazancı ve lazer yoğunluğunu ayarlayın. Daha sonra, kılcal damarın tüm hacmini kaplayan optik Z yığınlarını gerçekleştirmek için başlangıç ve bitiş bölümlerini oluşturun ve 0,45 mikrometrelik bir adım boyutu kullanın.
Daha da önemlisi, görüntüleme oturumu sırasında tüm çekim ayarları aynı tutulmalıdır.