Bir Fare Modelinde Viral Vektörlerin Retina Pigment Epiteline Subretinal Enjeksiyonu

Anestezi uygulanmış bir fare ile başlayın ve göz bebeği genişletici bir ajan uygulayın.

Mikroskop altında, göz kapağını açın ve enjeksiyon bölgesini ortaya çıkarmak için gözü hafifçe çıkıntı yapın.

Bir damla oftalmik viskoelastik solüsyon uygulayın, ardından retinayı görselleştirmek için bir lamel yerleştirin.

İnce bir iğne kullanarak, kan damarlarına ve lense zarar vermekten kaçınarak kornea-sklera bağlantısının arkasında bir delik açın.

Bu önceden delinmiş delikten, retina nöronlarını destekleyen retina pigment epitelinin veya RPE'nin yakınındaki subretinal boşluğa teğet olarak künt bir şırınga yerleştirin.

Hedef genleri taşıyan lentiviral vektörü subretinal boşluğa enjekte edin.

Sıvı birikimine bağlı bir subretinal bleb oluşumunu gözlemleyin ve başarılı vektör iletimini onaylayın.

Enjeksiyon bölgesini kaplamak için göz kapağını yavaşça kapatın ve farenin iyileşmesine izin verin.

Lentivirüs, endositoz yoluyla RPE'ye girer, genetik materyalini serbest bırakır ve onu, konakçı genomu ile bütünleşen ve gen ekspresyonunu sağlayan karşılık gelen DNA'ya dönüştürür.

İlk olarak, 33 gauge künt iğne ile mikrolitrelik bir şırınga hazırlayın. Etilen oksit gazı kullanarak sterilize edin. Daha sonra, PBS'deki viral vektörlerin bir mikro füj tüpünde mikrolitre başına yaklaşık 1 milyon titre biriminde bir seyreltme hazırlayın. Şimdi, şırıngayı yüklerken, şırıngadaki ölü alanı gidermek için solüsyonla birkaç kez yıkayın. 1,5 ila 2 mikrolitre enjekte etmeye hazır hale getirin.

Hazırlanan viral vektör enjeksiyonu ile, yetişkin bir fareyi intraperitoneal tiletamin, zolazepam ve ksilazin enjeksiyonu ile uyuşturun. Hayvanın refleks yokluğu nedeniyle anestezi altına alındığını onaylayın. Anestezi onaylandıktan sonra, öğrencilerini %0.5 fenilefrin ve %0.5 tropikamid damlasıyla genişletin. Şimdi, bir ameliyat mikroskobu altında, göz kapağını açın ve ekvatoru ortaya çıkarmak için gözü çıkıntı yapın. Parmaklarınızı orbital kenarın dışına yerleştirerek gözü bu konumda tutun.

Daha sonra, kornea yüzeyine oftalmik viskoelastik solüsyon uygulayın ve korneanın üzerine küçük yuvarlak bir kapak kaydırağı yerleştirin. Böylece retina görüntülenebilir. Şimdi, limbusun biraz arkasında ve sağ gözde daha aşağıda veya sol gözde üstünde, küçük bir delik açmak için steril bir 30 gauge yarım iğne kullanın. Geçici olarak yerleştirilen veya nazal olarak yerleştirilen delikler, kapatılması zor olduğu için iyi seçimler değildir.

Delme sırasında limbal damara veya merceğe çarpmayın ve iğnenin tüm eğimini sokmayın.

Subretinal enjeksiyonlar için, vektör enjeksiyon iğnesini iris düzlemine 45 derecelik bir açıyla delikten geçirin. Vitreus boşluğunu geçmek için belirtilen yolu takip ederek iğneyi arkaya doğru peripapiller alana doğru itin. RPE tabakasına ulaşıldığını gösteren hafif bir direnç hissedilene kadar iğneyi subretinal boşluğa yaklaştırın.

Skleral dokuya aşırı basınçla nüfuz etmeyin çünkü iğne potansiyel subretinal boşluğa yerleştirilmelidir. İğne kafatası dokusunu aşırı güçle delerse, direnç göstermeden göz dışı orbital boşluğa girer.

Şimdi, viral vektörü nazikçe subretinal boşluğa enjekte edin. Hayati önem taşıyan doku hasarını önlemek için iğneyi çok sabit tutun. Ardından, iğneyi aynı şekilde nazikçe çekin. Şimdi, göz küresi serbest bırakılabilir. Vektör birikimini gösteren subretinal kanama görünür olmalıdır. Son olarak, enjeksiyon bölgesini kaplamak için göz kapağını nazikçe kapatın. Deliğin kendi kendine sızdırmazlığı meydana gelecektir.