JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 2:39 dk • June 17th, 2025
Bir görüntüleme tamponu ile doldurulmuş bir görüntüleme odasında genetik olarak değiştirilmiş birincil nöronları içeren bir lamel alın.
Bu hücreler, mitokondriyal matriste floresan protein bazlı bir redoks indikatörünü eksprese eder.
Odayı bir floresan mikroskobu altında konumlandırın, hücreleri görünür ışık altında tanımlayın, ardından floresan görüntülemeye geçin.
Göstergeyi uyarmak ve floresan emisyonunu ölçmek için iki uyarma dalga boyu uygulayın.
Bu dalga boylarındaki floresan yoğunluk oranı, mitokondriyal oksidasyon durumunu yansıtır.
Hücresel NMDA reseptörlerini aktive etmek için NMDA'yı tanıtın, bu da hücre içi kalsiyum akışına neden olur.
Artış, mitokondriyal kalsiyum alımını tetikleyerek ROS üretimini ve mitokondriyal oksidasyonu indükler
.
ROS, göstergeyi oksitler, floresansını değiştirir ve sinyal oranını arttırır.
Sinyal oranını en üst düzeye çıkarmak için göstergeyi tamamen oksitlemek için oksitleyici maddeler ekleyin.
Tamponu çıkarın, ardından boyayı tamamen azaltmak ve sinyal oranını en aza indirmek için indirgeyici maddeler ekleyin.
NMDA kaynaklı mitokondriyal oksidasyonu kalibre etmek ve ölçmek için maksimum ve minimum sinyal oranlarını kullanın.
Canlı görüntüleme için hızlandırılmış çekim aralığını 30 saniyeye ve süreyi 25 dakikaya ayarlayın. Ardından, hücreleri monte edin, odayı mikroskobun üzerine yerleştirin ve hücreleri daha önce gösterildiği gibi odaklayın. Tarama moduna geçin ve görüntüleme için hücreleri odaklamak ve bulmak için canlı görüntüde 488 nanometre kanalını kullanın. İsteğe bağlı olarak, çalışma başına kaydedilen hücre sayısını artırmak için, her lamel için iki ila üç görünüm alanı görüntülemek üzere çok noktalı işlevi kullanın.
Zaman atlamalı çekimi başlatın ve iki dakikalık temel kayıt olarak beş görüntü kaydedin. 30 mikromolar nihai konsantrasyonu elde etmek için hazneye 500 mikrolitre üç kez NMDA çözeltisi ekleyin ve 10 dakikalık bir NMDA yanıtı olarak ek 20 görüntü kaydedin. Daha sonra, hazneye 500 mikrolitre dört kez DA çözeltisi ekleyin ve altı görüntü daha kaydedin. Tamponu görüntüleme odasından aspire edin ve 1 mililitre DTT çözeltisi ile değiştirin. 10 görüntü daha kaydettikten sonra kaydı sonlandırın ve görüntü serisini kaydedin.