İmmün Etiketli Astrositlerin Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Floresan etiketli astrositlerle bağışıklığı boyanmış bir fare beyni bölümü alın. Astrositin sitoplazması kırmızı floresan verirken, çekirdek mavi floresan verir.

Slaytı uygun bir objektif lens altında konfokal bir mikroskop tablasına yerleştirin.

Edinme yazılımını kullanarak odağı ayarlayın ve astrositin sitoplazmasını ve çekirdeğini etiketleyen floroforları seçin.

Canlı görüntülemeye başlayın ve elde edilen görüntüdeki gürültüyü azaltmak için görüntüleme parametrelerini optimize edin.

Alım parametreleri altında, daha yüksek kaliteli iki boyutlu bir görüntü yakalamak için düşük hızlı bir tarama modu seçin.

Astrositin en üst konumunu Z yığını için başlangıç noktası ve en düşük konumunu bitiş noktası olarak belirleyin.

Tam hücre derinliğini kaplayan dilim sayısını tanımlayın.

Astrositin üç boyutlu bir görüntüsünü oluşturmak için dilimleri birleştirin.

Konfokal mikroskobu başlatmak için, mikroskop tablasına bir slayt yerleştirin ve 63x objektifi seçin. Edinme yazılımını açtıktan sonra, Edinme sekmesinde Akıllı Kurulum'a tıklayın ve uygun floroforları seçin. Burada DAPI ve Alexa Fluor 555 kullanılmaktadır.

Ardından, En iyi sinyal'e ve ardından Uygula'ya tıklayın. Ardından, bilgisayarın en uygun pozlama parametrelerini belirlemesine izin vermek için Pozlamayı Ayarla'ya tıklayın.

Görüntüyü optimize etmek için Kanallar penceresini açın ve görüntüyü Canlı olarak değiştirin. Gerekirse odağı ayarlayın. Ardından iğne deliğini optimize etmek için 1 AU'ya tıklayın. En iyi yoğunluk için kazancı ayarlayın.

Son olarak, dijital kazancı 2 ile 3 arasında ayarlayın. Bu optimizasyondan sonra, canlı görüntüyü durdurun ve Edinme Modu penceresini açın. X'e Y'ye tıklayarak çerçeve boyutunu ayarlayın ve 1024'e 1024'ü seçin. Ayrıca, yavaş bir hız seçin.

Ardından, Ortalama sekmesini açın ve 4'ten büyük veya 4'e eşit bir sayı seçin. Ardından Snap düğmesine tıklayın ve yakalanan 2D görüntüyü kaydedin. 3D görüntülemeyi ayarlamak için Akıllı Kurulum sekmesini açın ve yığın penceresinin açılmasına neden olacak Z-Stack öğesini işaretleyin.

Z-Stack'in ilk ve son konumlarını ayarlamak için tekrar Canlı'ya tıklayın ve odağı astrositin en üst konumuna ayarlayın. Önce Ayarla'ya tıklayın. Şimdi odağı astrositin en alt konumuna ayarlayın ve Son Ayarla'ya tıklayın. Ardından canlı görüntüyü durdurun.

Ardından, dilim sayısını ayarlamak için Optimal'e tıklayarak aralığı seçin. Burada aralık 1.01 mikrometredir. Son olarak, Denemeyi Başlat'a tıklayın ve tarama tamamlandıktan sonra görüntüleri kaydedin.