Name: Yüksek Aktif Maya Ribozomlar Kromatografik Arıtma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Öğrenin, maya ribozomlarını kromatografik yöntemle saflaştırarak biyokimyasal ve yapısal analizler için yüksek kaliteli örnekler elde etmeyi. Bu teknik, kontaminasyonu azaltır ve ribozom aktivitesini korur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ashton Belew, Karen Jack Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima Shivani Reddy ve onların yardım ve bu projenin giriş Michael Rhodin Dinman laboratuvar üyeleri, teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği (AHA 0630163N), AM ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (5R01 GM058859-12) JDD bağışları ile destek verdi. JAL, 2009 ek ana hibe bir Amerikan Yatırım ve Kurtarma Yasası (3R01GM058859-11S1) tarafından desteklenmiştir.

1. Bir sistein hazırlanması Sulfolink reçine ücret <ol><li> Oda sıcaklığında Sulfolink reçine (Pierce) hazırlayın. </li><li> Her bir şişenin içine dağıtılan 5 ml, 10 ml% 50 olarak iki adet 10 ml plastik şişeleri, üretici tarafından sağlanan Sulfolink kaplin jel bulamaç toplam yerleştirin. </li><li> Kısaca 850 xg'de şişeleri santrifüj ve dikkatle süpernatantlar kaldırmak. </li><li> 5 ml boncuklar resuspending xg 850 kısaca santrifüj ve pipet ile süpernatantı çıkarmadan kaplin tamponu (50 mM Tris, pH 8.5, 5 mM EDTA) jel üç kez yıkayın. </li><li> Her tüp kaplin tamponu 50 mM L-sistein çözüm beş ml ekleyin ve 1 saat 25 bulamaç karıştırın ° C </li><li> Yukarıda adım 1.4 'de açıklandığı gibi yıkama L-sistein kalan çıkarın. </li><li> Jel 10 ml bağlayıcı tampon yeniden süspanse [20 mM Hepes, pH 7.6, 5 mM Mg (oac) 2, 60 mM NH 4 Cl, 2 mM DTT] ve reçine bağlayıcı tampon 10 ml yıkama ile dengelenmesi3 kez adım 1.4 'de açıklandığı gibi. Durusu reçine içine 10 ml santrifüj sütun, kap ve 4 saklanan ° C RNA bağlayıcı reçine kapasitesi ~ 20 ml başına 260 birimleri. </li></ol> 2. Sistein kullanarak ribozomların Kromatografik arıtma Sulfolink reçine ücret Not: Eğer proteaz aktivitesi bir sorun olduğunu kanıtlamaktadır bir yük ile çalışan, proteaz inhibisyonu kokteyller sonraki tüm tamponlar kullanılabilir. <ol><li> Buz üzerinde tüm bileşenlerini korumak ve RNaz-serbest su ve steril filtrasyon kullanan tüm çözümler hazırlıyoruz. </li><li> Büyümeye uygun ortam orta-log faz (1.2 OD 595 = 0.6) bir gecede maya hücreleri. Pelet hücreler santrifüj yoluyla, 4, 5 dakika boyunca 3700 xg bağlayıcı tampon ve santrifüj 1 gram hücreleri yıkayın ° C </li><li> Bağlayıcı tampon 1 ml yaklaşık toplam hacmi 2 ml ve 0,5 mm cam boncuklar 4 soğutulmuş bir eşit miktarda kullanarak bozabilir yeniden süspanse hücreler ° C uBiospec Mini-boncuk Bilo (Bartlesville, OK) şarkı. Örnekleri gerektiği gibi birden fazla tüp içine bölünebilir. </li><li> Beckman Coulter Optima Max E ultrasantrifüjdeki (Fullerton, CA) 30 dakika 30.000 xg'de santrifüj kesintisiz hücrelerin, organellerin ve hücresel enkaz çıkarın. </li><li> Kullanımdan hemen önce, pelet, 1.000 az bir dakika boyunca reçine depolama çözümü kaldırmak için xg. İki ml reçine, hücre, her bir gram için kullanılır. </li><li> Doğrudan tahsil Sulfolink bulamaç haline lipid fraksiyonu ya en üst ya da hücre artıkları tüplerin alt kısmında kirlenme, yer ve en aza indirmek için özen, 30.000 xg dönüş (S30) hücre lizat süpernatantlar çıkarın. Lipid tabakasının ya kaldırılması ya da ucu süpernatant geçti sonra pipetlemeyin dışarı iterek önlenebilir. </li><li> S30/Sulfolink karışımı 15 dakika boyunca karıştırma olmadan buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Sütun 15 ml konik tüpler içine yerleştirin ve 1000 xg'de santrifüjr bir dakika. </li><li> Sütunlar, el ile karıştırın ve buz üzerinde bir 15 dakika daha inkübe flowthrough fraksiyonları içine geri yerleştirin. </li><li> Sütunlar, 15 ml konik tüpler içine yerleştirin ve bir dakika için 1000 xg'de santrifüj. Flowthrough atın. </li><li> Kap sütun ve bağlayıcı tampon 5 ml ekleyin. Elle sütunları yeniden süspanse, kapakları kaldırmak ve bir dakika boyunca 1000 xg sütunları santrifüj santrifüj kadar karıştırın. Bu yıkama protokolü iki kez daha tekrarlayın. </li><li> 1.5 ml (20 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 10 mM Mg (oac) 2, 500 mM KCl, 2mm DTT, 0.5 mg / ml heparin) elüsyon tampon her sütun ekleyin. Elle çamurlar karıştırın ve 2 dakika boyunca buz üzerinde inkübe </li><li> Yeni 15 ml konik boru ve santrifüj içine koyun 1 dakika boyunca 1000 xg sütunlar. Eluat toplayın. Bir kez daha final kombine örnek hacmi ~ 3 ml olduğunu elüsyon adımı yineleyin. İkinci el reçine, heparin olmadan elüsyon tamponu ile yıkanır ve bağlayıcı Buffe ile dengelemer ve yeniden daha sonra kullanmak için bağlayıcı tampon 4 10 ml ° C saklanır. </li></ol> 3. Puromycin tedavi Not: tRNA türlerinin kirlenmesine neden kaldırmak için alternatif bir yöntem ribozom ikinci tur teşvik etmek için glikoz tükenmiş medya zengin bir glikoz geçmek için. Ancak, bu ribozom fonksiyonu ve konsantrasyonu etkileyebilir maya hücrelerinin metabolik durumunu değiştirmek. Endojen peptidil-tRNA, puromycin yapılan bir tedavi ribozomlar şerit için. <ol><li> Oda sıcaklığında 1M KOH damla damla ekleyerek pH 7.5 100 mM puromycin çözüm nötralize. </li><li> ~ 1mm eluat nihai konsantrasyonu nötralize puromycin çözüm ekleyin. </li><li> 1 mM nihai konsantrasyonu 100 mM GTP ekleyin. </li><li> 30 dakika boyunca inkübe 30 ° C </li></ol> 4. Gliserol yastıklar üzerinden sedimantasyon ribozomlar Saflaştırılması <ol><li> Bir ml4 ml'lik hacim, polikarbonat ultrasantrifüjdeki tüp içine minder tamponu (20 mM Hepes, pH 7.6, 10 mM Mg (oac) 2, 500 mM KCl, 2 mM DTT,% 25 gliserol). </li><li> Katmanı puromycin yavaşça 4 geceleme xg yastık üstüne elüsyon kesirler ve santrifüj örnekleri 100.000 ° C tedavi </li><li> Santrifüj rotor tüpleri çıkarın ve süpernatantlar aspire. </li><li> Pelet saflaştırılmış ribozom içeren yastık tampon 1 ml iki kez yıkayın. </li><li> Cam bir çubuk kullanarak nazik bozulma yastık tampon 100 ul ribozomlar tekrar </li><li> Kesinti sonra, parafilm tüpler kapak ve bir saat boyunca soğuk bir odaya girdap içinde ılımlı bir hızda sallamak. </li><li> Mikrosantrifüj tüp, maksimum hızda 5 dakika santrifüj 4 ° C, içeriği aktarın ve taze tüplerine süpernatantlar kaldırmak. </li><li> 4,1-4,7 o 100 ul depolama tampon (50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 50 mM NH 4 Cl, 5 mM Mg hariç 2 yastık tampon ml ve adımları tekrarlayın.(Oac) 2, 1 mM DTT,% 25 gliserol) yastık tampon yerine adımları 4.4 ve 4.5 kullanılır. </li><li> Sayısal olarak saflaştırılmış ribozomlar spektrofotometrik (1 A 260 = 20 maya ribozomların pmoles) ve -80 mağaza ° C 1 gram maya tipik sonuçları ribozom 300-400 pmoles. </li></ol> 5. Temsilcisi sonuçları: RNA türlerinin her protokol üç önemli adımlar çıkarılan bir örnek Şekil 2'de gösterilmiştir. RRNA olmasına rağmen en önemli türler toplam hücre lizatları bulunan (T), bu diğer RNA türlerinin çok sayıda da içerir. Sulfolink sütun (SL) arınmış ribozomlar da, bu türler için de sütun yatağın yüksek afinite nedeniyle tRNAs büyük miktarda içerir. Peptidil-tRNAs peptidler hidroliz puromycin sonuçları ile bu fraksiyonun Tedavi ve ribozomlar bu türlerin ayrılma teşvik etmektedir. Puromycin tedavi örnekleri (Pm) eksikliği co-purifyinböylece g tRNA türleri ve tamamen saf ribozomlar temsil eder. Daha önce 8 bildirildiği gibi, bu ribozom detaylı fonksiyonel ve yapısal analizler için ideal substratlar, son derece sağlam ve biyokimyasal olarak aktif. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Yöntemi Akış Şeması sulfolink reçine bağlı sistein kullanarak ribozomların Kromatografik arıtma tasvir edilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Ribozom hazırlıkları Temsilcisi analiz Total RNA türleri, daha sonra puromycin ile tedavi edilen toplam hücre lizatları (T), Sulfolink saflaştırılmış ribozomlar (SL) ve Sulfolink saflaştırılmış ribozomlar çıkarılan ve gliserol yastık (Pm) aracılığıyla tortulaşmış edildi . Lane M RNA boyutu belirteçler temsil eder. 25S ve 18S rRNA, tRNAs ve diğer RNA türlerinin yanı sıra temsil Gruplar gösterilir. Tümşeritli RNA 2 mg ile yüklendi.

<ol><li>Palade, G. E., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+microsomes%3B+an+integrated+morphological+and+biochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).</li>
<li>Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interactions+of+Escherichia+coli+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).</li>
<li>Jelenc, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+highly+active+ribosomes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli.</a> Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).</li>
<li>Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+bacterial+ribosomes+using+chloramphenicol+and+erythromycin+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns.</a> Biochimie. 62, 69-77 (1980).</li>
<li>Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+important+amino+acids+of+ribosomal+protein+L3+by+saturation+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis.</a> Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).</li>
<li>Algire, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+reconstituted+yeast+translation+initiation+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system.</a> RNA. 8, 382-397 (2002).</li>
<li>Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+chromatography+system+to+isolate+active+ribosomes+from+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria.</a> RNA. 14, 188-195 (2008).</li>
<li>Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purity%2C+activity+and+structural+integrity+of+yeast+ribosomes+purified+using+a+general+chromatographic+method%5BTitle%5D)+AND+%22RNA.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method.</a> RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).</li>
<li>Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNA+binding+to+80S+ribosomes+from+yeast%3A+evidence+for+three+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).</li>
<li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+puromycin+action%3A+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).</li>
<li>Nathans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromuycin+inhibition+of+protein+synthesis%3A+incorporation+of+puromycin+into+peptide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).</li>
<li>Rabinovitz, M., Fisher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dissociative+effect+of+puromycin+on+the+pathway+of+protein+synthesis+by+Ehrlich+ascites+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).</li>
<li>Allen, D. W., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+puromycin+on+rabbit+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).</li>
<li>Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+by+puromycin+of+amino+acid+incorporation+into+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).</li>
<li>Becker-Ursic, D., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+of+ribosomal+proteins+by+protein+kinases+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Ribozom arıtma protokolleri temelde düşük hızda spin sitozolik bir fraksiyonu hasat parçalama hücreleri içerir ve daha sonra yüksek hızda santrifüj 1 ribozomlar peletleme . Bakteri ribozomları temizlemek için bir kaç yeni yöntemler kullanılmış olsa da, aynı ökaryotlar 2-4 için doğru değildi. Maya ribozomlar biyokimyasal ve yapısal çalışmalar ek adımlar yaş, örneğin tuz yıkama ve gliserol minderler (örneğin: 5) boyunca eklenmiş olmasına rağmen, büyük olasılıkla, arıtma işlemi sırasında en...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Sulfolink Kaplin reçine </td><td> Delmek </td><td> 20402 </td></tr><tr><td> Mini boncuk-çırpıcı 16 </td><td> Biospec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> Optima Max E ultrasantrifüjdeki </td><td> Beckman Coulter </td><td></td></tr><tr><td> Legend RT </td><td> Sorvall </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 mm Cam boncuklar </td><td> Biospec </td><td> 11079105 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 252859 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54459 </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td></tr><tr><td> Mg (oac) 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5661 </td></tr><tr><td> KOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 221473 </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5516 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7255 </td></tr><tr><td> GTP </td><td> Fermentas </td><td> R0461 </td></tr></tbody></table>

yüksek aktif maya ribozomlar kromatografik arıtma

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Ökaryotik ribozomlar, böylece araştırmacılar için önemli bir meydan okuma poz eubacterial ve archael muadillerine göre çok daha dayanıksız. Özellikle sorunlu hücrelerin parçalanması, proteaz ve ribozomlar düşürebilir nükleazlar çok sayıda serbest olduğu bir gerçektir. Bu nedenle, mümkün olduğunca çabuk bu enzimler ribozom ayırmak için önemlidir. Ne yazık ki, geleneksel diferansiyel Ultrasantrifügasyon yöntemleri, yapısal bütünlüğünü ve işlevselliğini etkileyen bu enzimler zaman kabul edilemeyecek kadar uzun süre maruz ribozomlar bırakır. Bu sorunu çözmek için, bir sistein ücret Sulfolink reçine kullanarak kromatografik yöntem kullanmaktadır. Bu basit ve hızlı uygulama, sağlam, yüksek biyokimyasal aktif maya ribozomların yüksek verim üreten ortak arıtma proteolitik ve nucleolytic faaliyetleri, önemli ölçüde azaltır. Bu yöntem aynı zamanda memeli ribozomlar için geçerli olması gerektiğini düşündürmektedir. Sadeliğiyöntemi ve ökaryotik ribozomlar çalışma için önemli bir teknik ilerleme, kromatografik saflaştırılmış ribozom gelişmiş saflık ve aktivite gösterir.

Ortak arıtma nükleazlar ve proteazlar tarafından geleneksel yöntemlerle saflaştırılmış ökaryotik ribozomlar hazırlıkları kontaminasyonu mansap biyokimyasal ve yapısal analizleri olumsuz etkiler. Maya ribozomlar bir model sistem olarak kullanarak bu sorunu çözmek için basit ve hızlı bir kromatografik saflaştırma yöntemi kullanılır.

Yüksek Aktif Maya Ribozomlar Kromatografik Arıtma

Ökaryotik ribozomlar, eubakteriyel ve arkeal benzerlerine kıyasla çok daha labildir; bu durum araştırmacılar için önemli bir zorluk teşkil etmektedir. ...

Bu prosedürün genel amacı, bozulmamış ve yüksek aktiviteye sahip maya ribozomlarını saflaştırmaktır. Bu işlem, öncelikle hücrelerin lizis edilmesi ve ardından lizatın yüksek hızlı santrifüj ile berraklaştırılmasıyla gerçekleştirilir. S 30 defraksiyonunu elde etmek için, ribozomları saflaştırmak amacıyla sistein yüklü bir SFO link kolonu kullanılır.Bunu, son saflaştırma adımı olarak purmycin uygulaması ile kontamine tRNA'ların uzaklaştırılması takip eder. Ribozomlar yüksek hızda ultrasantrifüj işlemine tabi tutulur. Bu tekniğin ultrasantrifüj saflaştırması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sulfa link kolonunun kullanımının ribozomları kontamine ekzonükleaz ve proteazlardan hızla ayırmasıdır.Ayrıca, purmycin uygulama adımı, ribozomları tRNA'lar gibi kontamine RNA türlerinden ayırır. Bu adımlar, biyokimyasal ve yapısal çalışmalarda kullanılmak üzere yüksek verimde, yüksek aktiviteli ve sağlam saflaştırılmış ribozomların üretilmesini sağlar. Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırma görevlisi Jonathan Leschen gösterecektir.Bu protokole, üretici tarafından sağlanan sulfa link kenetleme jelinin %50'lik bulamacından iki adet 10 mililitrelik plastik tüpe, her bir tüpe beş mililitre gelecek şekilde pipetleyerek başlayın. Tüpleri kısa süreli olarak 850 ×g'de santrifüjledikten sonra süpernatantları dikkatlice uzaklaştırın. Boncukları beş mililitre kenetleme tamponunda yeniden süspande ederek ve ardından 850 ×g'de kısa süreli santrifüjleyerek jeli kenetleme tamponu ile üç kez yıkayın. Süpernatantı pipetle uzaklaştırın. Reçineyi yıkadıktan sonra, her tüpe kenetleme tamponunda hazırlanmış 50 milimolar L-sistein çözeltisinden beş mililitre ekleyin.Süspansiyonu 25 °C'de bir saat boyunca karıştırın. Ardından, reçineyi üç kez sadece kenetleme tamponu ile yıkayarak kalıntı L-sisteini uzaklaştırın. Sonrasında, jeli 10 mL bağlama tamponu içerisinde yeniden süspande edin ve reçineyi üç kez yıkayarak dengeleyin.Son olarak, reçineyi 10 mililitrelik bir santrifüj kolonuna boşaltın ve kapağını kapatın. Reçine dört derece santigrat sıcaklıkta saklanabilir ve ribozomların kromatografik saflaştırılması sırasında mililitre başına yaklaşık 20 ila 60 ünite reçine kapasitesine sahiptir. Sistin yüklü sulfa-link reçine kullanılarak.Tüm bileşenleri buz üzerinde tutun ve tüm çözeltileri RNA'dan arındırılmış su ve steril filtrasyon kullanarak hazırlayın. Maya hücrelerini uygun ortamda gece boyunca orta log fazına kadar büyütün. Hücreleri santrifüjle çöktürdükten sonra, bir gram hücreyi bağlama tamponu ile yıkayıp tekrar santrifüjleyin, ardından hücreleri yaklaşık iki mililitrelik bir toplam hacme ulaşana kadar bir mililitre bağlama tamponu içinde yeniden süspanse edin.Hücreleri, 4 °C'ye soğutulmuş eşit hacimde 0,5 mm cam boncuklar ve bir mini bead beader kullanarak parçalayın. Parçalanmamış hücreleri, organelleri ve hücresel kalıntıları bir ultrasentrifüj ile 30.000 ×g'de 30 dakika santrifüj ederek uzaklaştırın. Bu sırada, reçineyi 1000 ×g'de bir dakika boyunca çöktürün. Saklama solüsyonunu kullanımdan hemen önce uzaklaştırın.Her bir gram hücre için iki mililitre rezin kullanılır. Numunelerin ultrasantrifüj işleminin ardından, S 30 olarak adlandırılan 30, 000 ×g santrifüjden elde edilen hücre lizat süpernatanlarını uzaklaştırın. En üstteki lipid fraksiyonundan veya tüplerin altındaki hücre kalıntılarından kaynaklanacak kontaminasyonu minimize etmeye dikkat edin.Süpernatantları doğrudan yüklü SFO link bulamacına aktarın. S 30 SFO link karışımını 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Kolonları 50 mililitrelik konik tüplere yerleştirin ve bir dakika boyunca 1000 ×g'de santrifüjleyin, geçiş fraksiyonlarını tekrar kolonlara aktarın, kolonların kapaklarını kapatın ve karıştırmak için ters çevirin.Numuneleri buz üzerinde 15 dakika daha inkübe edin. Ardından kolonları 50 mililitrelik konik tüplere yerleştirin ve 1000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin, akış sıvısını atın. Beş mililitre bağlama tamponu ekledikten sonra kolonların kapaklarını kapatın ve yeniden süspanse olana kadar karıştırmak için ters çevirin.Kapakları çıkarın ve kolonları 1000 ×g hızda bir dakika boyunca santrifüjleyin. Bu yıkama protokolünü iki kez daha tekrarlayın. Ardından, her kolona 1,5 mL elüsyon tamponu ekleyin.Süspansiyonları elle karıştırın ve iki dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Son adım olarak, kolonları yeni 50 mililitre konik tüplere yerleştirin ve 1000 ×g'de santrifüjleyin. Bir dakika boyunca elüsatı toplayın ve toplam birleştirilmiş örnek hacimleri yaklaşık üç mililitre olacak şekilde elüsyon adımını bir kez daha tekrarlayın. Ribozomları endojen peptidil transferazdan ayırmak için, puromisin ile T-R-N-A-A işlemi gerçekleştirilir.Öncelikle, bir molar potasyum hidroksiti damla damla ekleyerek 100 milimolar purmısın çözeltisini pH 7.5'e nötralize edin. Oda sıcaklığına getirin. Nötralize edilmiş purmısın çözeltisini, elüatta yaklaşık bir milimolar nihai konsantrasyon olacak şekilde ekleyin.Ardından, nihai konsantrasyon bir millimolar olacak şekilde 100 millimolar GTP ekleyin. Karışımı 30 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, dört mililitre hacimli bir polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne bir mililitre yastıklama tamponu yerleştirin.Purmicin ile işlem görmüş elüsyon fraksiyonlarını yastığın üzerine nazikçe katmanlar halinde ekleyin ve örnekleri gece boyunca 100,000 ×g hızında santrifüjleyin. Süpernatantları aspire ettikten sonra, saflaştırılmış ribozomları içeren peletleri bir mililitre yastık tamponu ile yıkayın. Bu yıkama işlemini ikinci bir mililitre yastık tamponu ile tekrarlayın.Ardından Reza, cam bir çubuk yardımıyla nazikçe dağıtarak ribozomları 100 µL yastık tamponuna resüspande eder. Daha sonra, tüplerin üzerini parafilm ile kapatıp soğuk oda vorteksinde orta hızda çalkalar. Bir saatlik çalkalama işleminin ardından, içeriği bir mikrosantrifüj tüpüne aktararak dört °C'de maksimum hızda beş dakika boyunca santrifüj eder.Süpernatanları yeni tüplere aktarın. Süpernatanları bir ultrasantrifüj tüpündeki iki mililitre yastık tamponu üzerine katmanlar halinde ekleyin ve ardından 100,000 ×g hızında gece boyunca santrifüjleyin. Ertesi gün, tüpleri santrifüj rotorundan çıkarın ve süpernatanları aspire edin.Az önce açıklanan yöntemi kullanarak pelletleri yıkayın ve ribozomları saklama tamponu ile yeniden süspanse edin. Son olarak, saflaştırılan ribozomları -80 °C'de saklamadan önce spektrofotometrik olarak nicelendirin.Burada, toplam hücre lizatları, sulfo-link, saflaştırılmış ribozomlar ve ardından purmycin ile işlem görmüş ve gliserol yastığı üzerinden çöktürülmüş sufu-link saflaştırılmış ribozomlar dahil olmak üzere, protokolün üç ana adımının her birinden ekstrakte edilen RNA türlerine bir örnek gösterilmiştir. RNA boyut belirteçleri de gösterilirken, bizim RNA'larımız toplam hücre lizatlarında bulunan ana türlerdir. Bunlar ayrıca çok sayıda diğer RNA türünü de içermektedir.Sülfa link kolonundan saflaştırılan ribozomlar, kolon yatağının bu türlere olan yüksek afinitesi nedeniyle çok miktarda tRNA içerir. Bu fraksiyonun puromisin ile işlenmesi, peptidil-tRNA'lardaki peptitlerin hidrolizine yol açar ve bu türlerin ribozomlardan ayrılmasını teşvik eder. Puromisin ile işlenmiş saf numuneler, birlikte saflaşan tRNA türlerinden arınmıştır ve böylece tamamen saf ribozomları temsil eder.Daha önce rapor edildiği üzere, bu ribozomlar yüksek düzeyde sağlam ve biyokimyasal olarak aktiftir; bu da onları ayrıntılı fonksiyonel ve yapısal analizler için ideal substratlar haline getirir. Bu prosedürün ardından, ökaryotik ribozomların biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, ligandların ribozomlara bağlanmasını izleyen assayler ve yapısal analizler gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

chromatographic-purification-of-highly-active-yeast-ribosomes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz maya mitokondri arıtma için hızlı ve etkili bir yöntem...

Maya hücreleri Mitokondri saflaştırılması

Bu makale, ökaryotik hücrelerde ribozom tercüme çıkarılması için bir protokol tanımlamaktadır. Bir kez çıkarılan, ribozom, farklı ribozomal popülasyonlar analiz izin vermek için sukroz gradient fraksiyonlandırmasıyla monosomes ve polyribosomes içine ayrılır. Gibi, bu yöntem çeviri düzenleme incelenmesi için altın standarttır.

Ökaryotik Polyribosome Profil Analizi

Kaynak: Becker, B. ve diğerleri. Mayada Risin Toksin A Zinciri (RTA) kaçakçılığı için gerekli hücresel bileşenleri belirlemek için basit bir floresans tabanlı raporlayıcı testi. J. Vis. Exp. (2017).Bu video, polihistidin etiketli bir rekombinant proteinin nikel bazlı affinite kromatografisi kullanılarak arıtılmasını göstermektedir. Anahtar adımları belirtir; bunlar arasında sonikasyon yoluyla bakteriyel lizizi, lizatın aydınlaştırılması ve filtrasyonu ile imidazol kullanılarak hedef proteinin...

 Rekombinant Bakteriyel Proteinin Arındırılması için Afinite Kromatografi Tekniği

Yüksek kaliteli maya hücre ekstrelerinin hazırlanması bireysel proteinler veya tüm proteomlarda analizinde gerekli bir ilk adımdır. Burada protein fonksiyonları, etkileşimleri ve translasyon sonrası modifikasyonlar korumak için optimize edilmiştir tomurcuklanan maya hücreleri için, hızlı, verimli ve güvenilir homojenizasyon protokol açıklar.

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Bu yazıda çiçek mayası Saccharomyces cerevisiae içinde, sumoylation ve kinetochore proteinleri, Ndc10 ve Ndc80 ubikitinasyonuna bağlanmasını anlatır.

Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği

Burada hızlı, solubilize ve birçok ökaryotik Bor taşıyıcılar homoloji Maya kullanarak SLC4 taşıyıcı ailesi ile arındırmak için bir protokol mevcut. Ayrıca saf homomeric protein multimeric derleme için değerlendirmek için bir kimyasal cross-linking tahlil açıklar. Bu protokoller için zorlu diğer membran proteinlerinin adapte edilebilir.

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

Burada, mayada SNX-BAR heterodimerlerinin ifade, saflaştırma ve lipozom bağlanması için bir iş akışı salıyoruz.

Tomurcuklanan Maya SNX-BAR Heterodimers İfade, Arınma ve Lipozom Bağlayıcı

Standart laboratuvar ekipmanları kullanarak rekombinant PURE hücresiz TX-TL sistemini üretmek için hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz.

OnePot PURE Hücresiz Sistem

Canlı maya ve memeli hücrelerinde formaldehit çapraz bağlama ile çevirisel (protein biyosentez) kompleksleri hızla stabilize etmek için bir teknik sunuyoruz. Yaklaşım, geçici ara maddelerin ve dinamik RNA:protein etkileşimlerinin parçalanarak parçalanmasını sağlar. Çapraz bağlantılı kompleksler, derin sıralama tabanlı profil oluşturma yöntemleri, mikroskopi ve kütle spektrometresi gibi birden fazla aşağı akış uygulamasında kullanılabilir.

Ökaryotik Hücrelerden Çeviri Komplekslerinin Hızlı In Vivo Fiksasyonu ve İzolasyonu

Ko-translasyonel etkileşimler, yeni zincir modifikasyonlarında, hedeflemede, katlamada ve montaj yollarında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada, ökaryot Saccharomyces cerevisiae modelinde bu etkileşimlerin in vivo, doğrudan analizi için bir yöntem olan Seçici Ribozom Profillemeyi açıklıyoruz.

Ko-Translasyonel Etkileşim Ağlarının Seçici Ribozom Profilleme ile Küresel Tanımlanması

Bu protokol, tomurcuklanan maya, Saccharomyces cerevisiae'den doğal kromatin bağlamında ilgilenilen tek kopyalı bir gen lokusunu saflaştırmak için bölgeye özgü rekombinasyona dayalı lokusa özgü bir kromatin izolasyon yöntemi sunar.

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

Öğrenin, maya ribozomlarını kromatografik yöntemle saflaştırarak biyokimyasal ve yapısal analizler için yüksek kaliteli örnekler elde etmeyi. Bu teknik, kontaminasyonu azaltır ve ribozom aktivitesini korur.

Yüksek Aktif Maya Ribozomlar Kromatografik Arıtma

Daha fazla video keşfet