Fare Beyin Dokusundaki Miyelinli Nöronları Görselleştirmek için Tutarlı Anti-Stokes Raman Spektroskopisi

Çok kuyulu bir plakada kimyasal olarak sabitlenmiş bir fare beyni dilimi alın.

Doku, lipid açısından zengin miyelin kılıfları ile çevrili aksonlar içerir. Hücre gövdeleri, kaba endoplazmik retikulum ve ribozomlardan oluşan Nissl cisimcikleri içerir.

Floresan bir Nissl boyası içeren bir geçirgenlik çözeltisinde inkübe edin. Çözelti, hücresel zarları geçirgen hale getirerek, lekenin Nissl cisimcikleri içindeki ribozomal RNA'ya bağlanmasına ve hücre cisimlerini etiketlemesine izin verir.

Dokuyu tutarlı bir anti-Stokes Raman spektroskopisi veya CARS görüntüleme sistemi ile konfokal bir mikroskop altına yerleştirin.

Lipid açısından zengin miyelin kılıfındaki moleküler bağları uyarmak için ayarlanmış, doku üzerine doğrudan senkronize pompa ve Stokes lazer ışınları.

Uyarılmış bağlarla etkileşime girmek ve miyiyeline özgü bir anti-Stokes sinyali üretmek için bir prob lazer ışını tanıtın.

Bir fotodetektör, miyiyeline özgü bir görüntü oluşturmak için sinyali yakalar.

Etiketli Nissl gövdelerinden gelen sinyalleri yakalamak için konfokal görüntülemeyi kullanın.

Nöronal mimariyi görselleştirmek için konfokal ve CARS görüntülerini üst üste bindirin.

Dokuları el yazmasında anlatıldığı gibi hazırladıktan sonra, hücre gövdelerini görselleştirmek için Nissl ve antikor ortamı için serbest yüzen bölümleri boyayın. Ardından, bölümleri standart bir laboratuvar çalkalayıcıda oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Numuneleri mikroskoba getirmeden önce CARS lazerini açın ve en az bir saat ısıtın. Ardından, pompa ve Stokes lazer ışınlarını uzamsal olarak üst üste bindirerek CARS lazerini hizalayın ve iki lazer ışını arasındaki gecikmeyi ayarlayın.

Kohler, ileri CARS görüntüleme için kondansatör optiği ve mikroskobun diyaframı. Ardından, uzamsal olarak üst üste binen iki lazeri mikroskobun tarama kafası aynalarına ortalamak için harici periskopu ayarlayın. En iyi ileri CARS taranmamış algılama için, kondansatörün kohlered olduğundan emin olun.

İmmünofloresan konfokal görüntüleme ve CARS görüntüleme için, floresan görüntüleme için görünür lazerlerle donatılmış bir konfokal mikroskop dahil ederek CARS lazerini hem ileri hem de epi-CARS taranmamış dedektörlerle donatın. Şimdi, dokunun kurumasını önlemek için bölümleri lamel tabanlı ve PBS'li bir kültür kabına yerleştirin. Ayrıca, dokuyu lamel yakınında tutmak için bir cam ağırlık kullanın.

Grafik kullanıcı arayüzünü kullanma. CARS ve Nissl floresan konfokal görüntüleme için görüntü alma parametrelerini ayarlayın. Numuneyi mikroskop tablasına yerleştirin. Örneğe odaklanın ve görüntüleri yakalayın.