Larva Zebra Balıklarının Lateral Çizgi Tüy Hücrelerinde Kalsiyum Dinamiğinin Görüntülenmesi

Bir perfüzyon odasına monte edilmiş felçli bir transgenik zebra balığı larvasını alın.

Larva, su hareketini algılayan yanal çizgi sisteminin bir bileşeni olan nöromastın tüy hücrelerinde zar lokalize kalsiyum göstergelerini ifade eder.

Saç hücreleri, sinyalleri iletmek için afferent nöronlarla sinapslar oluşturan apikal saç demetleri ve bazal presinaptik bölgelerden oluşur.

Konfokal mikroskop altında, larvanın yakınına bir sıvı jeti pipeti yerleştirmek için düşük büyütme kullanın.

Bir nöromastın yerini belirlemek için büyütmeyi artırın, pipeti yanına yeniden yerleştirin ve

floresan görüntülemeye geçin.

Kalsiyum iyonları da dahil olmak üzere apikal katyon akışı için mekanotransdüksiyon kanalları açarak saç demetlerini saptırmak için sıvı darbeleri verin.

Zayıf floresan göstergeler kalsiyuma bağlanarak floresanda lokalize bir artışa neden olur.

Katyon akışı hücreyi depolarize eder, bazal presinapstaki voltaj kapılı kanallardan kalsiyum girişini tetikler, burada göstergelere bağlanır ve lokal olarak floresansı arttırır.

Apikal ve bazal kalsiyum dinamiklerini gerçek zamanlı olarak görselleştirin.

Bu prosedürde, 10 mikrolitre nöronal tamponu, bir jel yükleme ucu kullanarak uygun şekilde kırılmış bir sıvı jet iğnesine geri doldurun. Çözeltiyi kabarcıklar olmadan uca eşit şekilde yükleyin. Ardından iğneyi motorlu mikromanipülatöre bağlı pipet tutucusuna yerleştirin.

Perfüzyon odasını mikroskop tablasındaki dairesel bir oda adaptörüne yerleştirin. Motorlu sahneyi, larva görüş alanının merkezinde olacak şekilde hareket ettirin. Daha sonra, dairesel oda adaptörünü, larvaların AP ekseni sıvı jet iğnesinin yörüngesi ile kabaca hizalanacak şekilde çevirin.

İletilen ışığı ve diferansiyel girişim kontrastını kullanarak larvayı odağa getirin ve 10x objektifin altında ortalayın. Ardından 10x hedefini yükseltin. Motorlu mikromanipülatörü kullanarak, sıvı jet iğnesini görüş alanının merkezine getirin, böylece iletilen ışıkla aydınlatılır ve nöronal tampona zar zor dokunur.

Konumunu doğrulamak için larvaya odaklanmak için 10x hedefini düşürün. Hedefi sıvı jeti iğnesine odaklayın. Sıvı jet iğnesini, larvaların sırt tarafına paralel bir konuma gelene kadar x ve y eksenlerinde mikromanipülatör ile hareket ettirin.

Daha sonra tekrar larvaya odaklanın. İğneyi z ekseninde aşağı indirin ve iğneyi balığın sırt tarafı boyunca, vücuttan 1 milimetre uzağa yerleştirin. Sıvı jeti iğnesinin larvanın AP orta hattı boyunca hizalandığından emin olmak için dairesel hazne adaptörünü dikkatlice hareket ettirin.

Ardından, 60x su hedefine geçin. Hedefin nöronal tampona daldırıldığından emin olun. Bir nöromastın yerini belirlemek için ince odağı kullanın. Daha sonra, ilgilenilen nöromastı görüş alanının merkezine yerleştirmek için motorlu sahneyi hareket ettirin.

Sıvı jet iğnesinin ucunu balığın sırt tarafı boyunca tutun. Sıvı jet iğne ucunu larvaya veya hazne yüzeyine dokundurmayın. Sıvı jet iğnesini mikromanipülatör ile nöromastın dış kenarından 100 mikrometre uzakta olacak şekilde konumlandırın.

Ardından apikal saç demetlerinin uçlarına odaklanın. Sıvı jet iğnesinin alt kısmı bu düzlemde odakta olmalıdır. Görüntüleme yazılımından giriş almak için yüksek hızlı basınç kelepçesini manuel moddan harici moda ayarlayın. Yüksek hızlı basınç kelepçesini sıfırlayınamp sıfır düğmesine basarak ve dinlenme basıncını biraz pozitif olarak ayarlamak için ayar noktası düğmesini kullanın. Kafa tablası çıkışına bağlı bir PSI manometre kullanarak yüksek hızlı basınç kelepçesinin dinlenme çıkışını onaylayın.

Saç demetlerini uyarmak için gereken basıncı belirlemek için, 200 ila 500 milisaniye boyunca 0,125 ve 0,25 volt çıkışlı bir test uyarıcısı uygulayın. Her test uyaranı için, saç demetlerinin (kinocilia) uçlarının sapma mesafesini ölçün. Demetleri yaklaşık 5 mikrometre mesafeye hareket ettiren bir basınç seçin. Kinosilia uçlarının tüm zaman boyunca odakta kaldığından emin olun.

Tek düzlemli görüntüler elde etmek için, üç saniyede 30. kareden sonra 80 karelik çekim sırasında iletilecek bir uyaran seçin. Mekanosensitif kalsiyum tepkilerini ölçmek için apikal saç demetlerinin tabanına odaklanın ve görüntü almaya başlayın. Presinaptik kalsiyum tepkilerini ölçmek için saç hücrelerinin tabanına odaklanın ve görüntü elde etmeye başlayın.