Parkinson Hastalığının tek taraflı lezyonlanmıştır 6-OHDA Mouse Model Geliştirme

Bu prosedürün genel amacı, bir Parkinsonizm fare modeli oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle cerrahi için ilaçların hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Bir sonraki adım cerrahi aparatın kurulmasıdır, ardından uygun ameliyat sonrası bakımın ardından tek taraflı altı hidroksi dopamin lezyon cerrahisi uygulanır.

Altı hidroksi dopamin lezyonlu hayvanlar davranışsal deneyler için kullanılabilir. Sonuçlar nihayetinde, tek taraflı olarak medial dört beyin demetinde %95'ten fazla dopamin tükenmesi olduğunu göstermektedir. Bireylerin bu prosedürde dikkat etmesi gereken en önemli iki husus; ilk olarak, hayvanların hayatta kalmasını sağlamak için uygun postoperatif bakımdır.

İkinci olarak, nörotoksin iletiminin tam olarak gerçekleşmesini sağlamak için altı hidroksi dopamin infüzyon ekipmanlarının hazırlığına özen gösterin. Bu prosedüre başlamak için cerrahi aletleri bir otoklavda sterilize edin. Ardından, tüm yüzeyleri ve ekipmanları izopropil alkol ile temizleyin.

Ardından, tabanına kağıt havlular yerleştirilmiş bir fare iyileşme kafesi hazırlayarak ameliyat sonrası süreci planlayın. Anestezi arabasını kurmak için kafesi bir ısıtma lambasının altına veya ısıtmalı bir pedin üzerine yerleştirin. Oksijen girişinin bağlı ve açık olduğundan ve izofloran rezervuarının tamamen dolu olduğundan emin olun.

Ardından, oksijen akışını %1'e ve izofloran akışını %2 ila %4'e ayarlayın. Bir sonraki adım infüzyon düzeneğinin kurulmasıdır. Peak tüpünün bir yanına önce bir RN metal somun, ardından peak cup ferrulü takın. Daha sonra kanonik PFA ferrulü ekleyin; ferrulleri, kanonik PFA ferrulündeki koninin peak cup ferrulünün eşleşen parçasına gireceği şekilde yönlendirin.

Ardından, eşleştirilmiş peak cup ve kanonik PFA feral parçalarını çift küçük hub RN kuplörünün uçlarına yerleştirin ve çift küçük hub RN kuplörünün diğer ucundaki RN metal somunu sıkın. 33 gauge bir enjeksiyon iğnesi yerleştirin. İğneyi RN metal somunlardan birinin içinden geçirin ve somunu sıkın.

33 gauge iğnenin, çift küçük hublı RN kuplörüne 180 derecelik bir açıda olduğundan emin olun. Ardından, peak borusunun diğer ucuna bir RN metal somun ve ardından bir peak cup ferul takın. Sonrasında, kanonik PFA ferulü ikinci çift küçük hublı RN kuplörünün daha derin olan oluğuna yerleştirin ve bağlantıyı sabitlemek için RN metal somunu sıkın.

Ardından, ikinci küçük çift RN hub bağlayıcının diğer ucuna, küçük hub RN adaptörü için olan lure'u yerleştirin ve bağlantıyı sabitlemek için lure'un RN metal somununu sıkın. İnfüzyon düzeneğinin kurulumu şimdi tamamlanmıştır. Bir sonraki hazırlık adımı, infüzyon düzeneğinin havasının alınmasıdır.

İlk olarak, 250 µL ve 1 µL'lik Hamilton şırıngalarını steril su ile doldurun. Hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Ardından, 250 µL'lik şırıngayı luer adaptöre takın ve 250 µL'lik şırınganın pistonuna, suyun tüpün diğer ucundaki 33 gauge enjeksiyon iğnesinden çıkacağı şekilde bastırın.

250 µL'lik şırıngayı lure adaptöründen çıkarırken sistemden su itmeye devam edin. Lure adaptörünün ucunda küçük bir su damlacığı bırakarak, bir µL'lik şırınganın pistonunu küçük bir su damlacığı çıkana kadar bastırın. Ardından, bir µL'lik şırıngayı dikkatlice lure adaptörüne yerleştirin.

Bir mikrolitrelik şırıngadaki su damlacığının, luer adaptördeki su damlacığıyla birleştiğinden emin olun. Ardından, bir mikrolitrelik şırıngayı luer adaptöre tamamen yerleştirin ve küçük çift RN hub kuplöründe hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Şimdi perfüzyon düzeneğini stereotaksik çerçeveye ve infüzyon pompasına sabitleyin; 33 gauge enjeksiyon iğnesi ile birlikte küçük çift RN hub kuplörünü stereotaksik çerçevenin manipülatör koluna clamp ile sabitleyin.

Ardından, bir mikrolitrelik şırıngayı perfüzyon pompasına sabitleyin. Bundan sonra, operasyondan 30 dakika önce, infüzyon pompasını dakikada 0.1 mikrolitre infüzyon hızına izin verecek şekilde programlayın. Hayvanı tartın ve ağırlığını kaydedin.

Fareye intraperitoneal enjeksiyon yoluyla 2,5 mg/mL dopamin hidroklorür ve 0,5 mg/mL parline hidroklorür karışımını 10 mL/kg dozunda uygulayın. Ardından, cerrahi işlem sırasında hayvanın vücut ısısını korumak için kulak barları ve kesici diş barının altına sıcak bir ısıtma diski yerleştirin ve dopamin hidroklorür ile parline hidroklorür karışımı enjeksiyonundan 15 dakika sonra hayvanı stereotaksik çerçeve kulak ve kesici diş barlarına uygun olacak ideal yüksekliğe getirin.

Fareyi kapalı bir nöbet kamerasına yerleştirin. Hayvanı izofloran inhalasyonu ile anestezi edin. Hayvan, arka bacak sıkıştırmasına yanıt vermediğinde ve göz kırpma refleksi kaybolduğunda yeterince anestezi edilmiş demektir.

Ardından farenin başının üst kısmını tıraş edin. Bu aşamada fareyi stereotaksik çerçeveye yerleştirin. Kesici diş çubuğunu ağzına ve anestezi maskesini yüzünün üzerine yerleştirin.

Ardından izofloran akış hızını ayarlayın. Topikal analjezik lidokaini pamuk kullanarak doğrudan cilde uygulayın. Kafatasının üst kısmını düzlemek için insizör barı ve kulaklıkları ayarlayın.

Ardından cildi Betadine solüsyonu ile sterilize edin. Sonra, kulak kaplarını yerleştirin. Baş tamamen düz olduğunda ve her iki yöne de hareket ettirilemediğinde kulak kapları doğru şekilde yerleştirilmiş demektir.

Ardından, bir bistüri ucu kullanarak başın orta hattı boyunca kesi yapın ve deriyi geri çekin. Kafatasının yüzeyini bir gazlı bezle kurulayın. Bir mikrolitrelik şırınganın pistonunu aşağı itin ve 33 gauge enjeksiyon iğnesini, 15 mg/mL konsantrasyondaki bir mililitrelik tüpün içine yerleştirin.

Alüminyum folyo ile kaplanmış altı hidroksi dopamin çözeltisi. 33 gauge enjeksiyon iğnesi altı hidroksi dopamin çözeltisinin içinde tutulurken, piston yavaşça geri çekilir. Ardından, küçük bir damla oluşturmak amacıyla az miktarda altı hidroksi dopamin çözeltisi dispense etmek için enjeksiyon iğnesinin ucu B bgma'ya doğru ilerletilir.

Ardından, enjeksiyon iğnesi ucunu yavaşça aşağı indirin. Boncuk bgma ile temas ettiğinde, iğnenin ilerlemesini durdurun ve bu koordinatları kaydedin. Enjeksiyon iğnesini dorsal yönde iki milimetre geri çekin ve sagital sütür boyunca Lambda'ya doğru rostral coddle yönünde ilerleyin.

Lambda'nın üzerine geldiğinde, küçük bir damlacık oluşturmak için enjeksiyon iğnesinden az miktarda altı hidroksi dopamin çözeltisi damlatın. Ardından iğne ucunu yavaşça lambda'ya doğru indirin. Damlacık Lambda'ya değdiğinde, iğneyi ilerletmeyi durdurun ve bu koordinatları kaydedin.

Medial lateral ve dorsal ventral koordinatlar BMA ve Lambda için aynı olmalıdır. Eğer değilse, kesici diş çubuğunu buna göre ayarlayın. Anterior posterior koordinatlar ve medial lateral koordinatlar için kulak çubukları için iğneyi enjeksiyon koordinatlarına taşıyın.

AP -1.2 mm, ML -1.1 mm göreceli koordinatlarda, küçük bir damla oluşturmak için enjeksiyon iğnesinden az miktarda solüsyon damlatın. Deliğin açılacağı konumu işaretlemek için küçük damlayı kafatası üzerine yerleştirin. Ardından iğneyi geri çekin ve 25 gauge bir iğne kullanarak kafatasında bir delik açın.

Enjeksiyon iğnesini enjeksiyon koordinatlarına geri getirin ve iğneyi dorsal ventral yön boyunca eksi beş milimetreye kadar yerleştirin. Ardından, median ön beyin demetine tek taraflı olarak 0,1 mikrolitre/dakika hızında 0,2 µL 6-hydroxy dopamine veya taşıyıcı solüsyon infüze edin. 6-hydroxy dopamine veya taşıyıcı solüsyon uygulaması tamamlandığında, enjeksiyon bölgesinden difüzyonun gerçekleşmesi için iğneyi beş dakika daha yerinde bırakın.

Ardından, iğneyi yavaşça geri çekin, saç derisindeki insizyonu üç dikişle kapatın ve ardından deri altına bir mililitre laktatlı ringer çözeltisi uygulayın. Son olarak, hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın ve bilinci yerine gelene kadar iyileşme kafesine yerleştirin. Altı hidroksi dopamin lezyon cerrahisinden 15 ila 21 gün sonrası.

Nörotoksinin neden olduğu hücre ölümü miktarı tamamlandığında, altı hidroksi dopamin lezyonunun başarısını değerlendirmek için spontan 360 derecelik rotasyonlar ölçülebilir. Bu davranışsal değerlendirmede, altı hidroksi dopamin ile indüklenen dopamin tükenmişliği %95'ten fazla olan fareler, kısmi altı hidroksi dopamin ve sham operasyonlu lezyonu olan farelere göre anlamlı derecede daha fazla IP subversive rotasyon sergiler. Her hayvandaki SAL dopamin seviyeleri ile spontan IP subversive rotasyon yüzdesi korele edildiğinde, altı hidroksi dopamin lezyonu ile %70 veya daha fazla IP subversive rotasyon sergileyen farelerin, Sal dopaminin %95'inden fazlasını kaybettiği görülür.

Bu videoyu izledikten sonra, farelerde stereotaksik ve perfüzyon kontrollü altı hidroksi dopamin lezyonunun nasıl etkili bir şekilde gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir. Bu işlem, %95'in üzerinde bir dopamin eksilmesine yol açacaktır. Ayrıca, farelerde Parkinsonizm'in davranışsal değerlendirmesinin nasıl yapılacağını da anlamış olmalısınız.