$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Çok kuyulu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirilen kimyasal olarak sabitlenmiş ve geçirgen murin kas lifleri ile başlayın.
Spesifik olmayan antikor bağlanmasını en aza indirmek için bir bloke edici çözelti içinde inkübe edin.
Nöromüsküler kavşakta veya NMJ'de eksprese edilen presinaptik bir proteini hedefleyen birincil antikorlar ekleyin.
Bağlanmamış antikorları çıkarmak için tamponla yıkayın.
Primer antikorları hedefleyen florofor konjuge ikincil antikorlar ve postsinaptik asetilkolin reseptörlerine bağlanan florofor konjuge bir nörotoksin ile inkübe edin.
Bağlanmamış reaktifleri çıkarmak için tampon ile yıkayın.
Elyafları montaj ortamı olan bir kızak üzerine yerleştirin, bir lamel yerleştirin ve elyafları düzleştirmek için silindirik mıknatıslarla sabitleyin.
Konfokal-STED mikroskobu kullanarak görüntülemeye başlayın.
Lazer aydınlatması üzerine, etiketli proteinler floresan yayılır.
Konfokal mikroskopi, sınırlı çözünürlüğü ve floresan yayılımı nedeniyle daha ince NMJ yapılarını net bir şekilde çözemez.
Buna karşılık, STED mikroskobu, floresan yayılımını bastırmak için bir tükenme lazeri kullanır ve net NMJ görselleştirmesine izin verir.
Ötenazi sonrası, iki ince tırtıklı forseps kullanarak yaklaşık 1 milimetre genişliğinde küçük lif demetleri halinde tibialis ön kaslarını alay etmeye başlayın. Daha sonra bu kas demetlerini PBS'de hazırlanan% 1 Triton X-100 içeren 24 oyuklu bir plakaya aktarın ve oda sıcaklığında bir saat veya 4 santigrat derecede beş saat boyunca hafifçe çalkalamasına izin verin.
Numuneleri oda sıcaklığında PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkadıktan sonra, numuneleri PBS'de hazırlanan% 1 Triton X-100 ile% 4 BSA'dan oluşan bir bloke edici çözelti ile hafif çalkalama altında 4 santigrat derecede dört saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, presinaptik akson terminallerini veya aktif bölgeleri etiketlemek için sırasıyla nörofilament M veya sinaptik vezikül glikoprotein 2'ye karşı birincil monoklonal antikorlar içeren aynı bloke edici çözelti ile numuneleri gece boyunca inkübe edin.
Ertesi gün, etiketli kas demetlerini hafif çalkalama altında PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra, oda sıcaklığında iki saat boyunca bir çalkalayıcı üzerine yerleştirerek uygun ikincil antikorlarla inkübe edin. Kas demetlerini tekrar yıkadıktan sonra, montaj ortamı olan bir kaydırak üzerine yerleştirin. Daha sonra üstüne 1.5 dereceli bir cam lamel yerleştirin, ardından baskı uygulamak ve kasları düzleştirmek için sürgünün her iki tarafına silindirik mıknatıslar yerleştirin.
Konfokal mikroskobu kullanarak görüntü elde etmek için, mikroskop yazılımını başlatın ve yapılandırma modu olarak Makine'yi seçin ve metin el yazmasında belirtilen ayarlara göre her deney grubundaki nöromüsküler kavşakların görüntü yığınlarını toplayın. Oturumun sonunda, 3D Görüntüleyicide Aç'a tıklayın ve 3D etiketlemeyi görselleştirmek için bir deney grubunun nöromüsküler kavşak temsilcisini seçin.