Lignocellulosic Malzemeler için Yüksek verim Saccharification Testi

Merhaba, ben Kara Ted, ben de Leo. Ben başladım. Ben de Simon McQueen Mason.

Bitki biyokütlesinin sindirilebilirliği, günümüzde büyük ilgi gören bir konudur. Bunun nedeni, bu biyokütleyi oluşturan bitki hücre duvarlarının polisakkaritlerinde çok miktarda şeker hapsolmuş olmasıdır ve eğer bu şekerleri kullanılabilir formda açığa çıkarabilirsek, bunları fermente ederek yakıtlar ve kimyasallar gibi her türlü ürünü üretebiliriz. Ne yazık ki, bu materyallerin sindirimi son derece zordur ve bu sindirilebilirliği neyin kontrol ettiğine dair daha iyi bir anlayış geliştirmek aciliyet arz eden bir konudur.

Yenilenebilir grup üretimi için bitki materyallerini kullanabilmek adına, bu bitkilerdeki şekerleştirme potansiyelini ölçebilmemiz gerekir. Bu nedenle, York Üniversitesi'nde şekerleştirme potansiyellerini belirlemek amacıyla geniş bitki materyali popülasyonlarını tarıyoruz. Şekerleştirme, değerli kimyasalları farklı endüstriyel süreçler aracılığıyla üretmek için kompleks karbonhidratların monosakkarit bileşenlerine parçalanması işlemidir.

Sakarifikasyon potansiyelini ölçmek için, açığa çıkan şekerleri belirlemek amacıyla biyokütleyi bir ön işleme ve enzim hidrolizine tabi tuttuğumuz endüstriyel süreçleri mikro ölçekli bir düzeyde yeniden canlandırıyoruz. Bu işlem, genotiplerdeki ilgi çekici varyetelerin belirlenmesini sağlar. Yüksek verimli sistem, IG altı kuyucuklu plaka formatında çalışmaktadır.

Genotipler arasındaki ince farklılıkları ortaya çıkarmak için hafif hidroliz koşulları kullanılır ve bu yöntem, farklı substrat materyallerini desteklemenin yanı sıra farklı enzimlerin değerlendirilmesine olanak tanıyacak kadar esnektir. Kullandığımız yöntem, bitki materyalinin toz haline getirilmesini ve ardından 90 °C'de 20 dakika boyunca seyreltilmiş bir asit veya alkali ile ön işlemden geçirilmesini içerir. Sonrasında, ticari bir sellülaz karışımı kullanılarak 50 °C'de sekiz saat boyunca enzim sindirimi gerçekleştirilir.

Son olarak, indirgen şekerlerin salınımını belirlemek için bir MBTH yöntemi kullanılır. Bitki materyali, dört milimetrelik segmentler halinde kesilmiş kuru gövdeler olarak hasat edilir. Bunlar, üç adet beş milimetrelik metal bilye ile birlikte iki mililitrelik viallere yerleştirilir.

Flakonlar, numunelerin izlenebilirliğini sağlamak amacıyla taratılan barkodlarla tek tek etiketlenir. Numuneler, robotlardaki öğütme ve formatlama robotlarına yüklenir. Biyokütlenin 96 kuyucuklu plakaya dağıtılmasına olanak sağlamak için numuneler otomatik olarak öğütülür ve karıştırılır.

Flakonlar delinir, ardından flakon, tozu dağıtmak için titreşen bir huni içine yerleşecek şekilde robotik kolla yeniden konumlandırılır. Huninin titreşimi, kuyu başına dağıtılan hedef kütle miktarını sağlamak amacıyla bir terazi tarafından düzenlenir. Biyokütle, plakaların 10 sütununa dağıtılır ve standartlar için iki sütun boş bırakılır.

Numune başına dört tekrar yaparak, plaka başına 20 numune yüklüyoruz. Bu plakanın hidrolizatı, PCR plakalarına üç kez aktarılarak üç optik plaka elde edilir. Bu sayede, biyokütle kuyucuğunun başına indirgen şekerler için üç belirleme yapmış oluruz.

Formatlama işlemi tamamlandıktan sonra, buharlaşmayı önlemek için plakalar silikon bir mat ile mühürlenir. Hazır olduklarında, sıvı taşıma robotuna aktarılırlar. Sıvı taşıma robotunda ön işlem, enzim hidrolizi ve açığa çıkan şekerlerin belirlenmesi işlemleri otomatik olarak gerçekleştirilir.

İki metrelik masa, gerekli farklı reaktifler için kapların yanı sıra plastik malzemeler için depolama alanına sahiptir. Ön işlem ve hidroliz için inkübatörlerin yanı sıra şeker tayini için termosikletörler bulunmaktadır. Ön işlem, derin kuyucuklu plaka içerisinde gerçekleştirilir.

Biyokütle tozuna seyreltik asit veya alkali çözeltiler eklenerek işlem gerçekleştirilir. Plakalar ısıtma bloğuna aktarılır ve 90 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edilir. Bu inkübasyon tamamlandığında, ön işlem 500 µL asetat tamponu ile beş kez durulanarak uzaklaştırılır.

Ön işlem durulandıktan sonra, bir enzim kokteyli eklenir. Bu, standart bir karışımdır. Karışım, kuyuk başına 7 FPU konsantrasyonunda, dört bir oranında sellüloz ve novozyme 1, 8 8 içerir.

Plakalar, çalkalamalı inkübatörde 50 °C'de sekiz saat boyunca inkübe edilir. Elde edilen hidrolizattan 75 µL bir PCR plağına aktarılır. PCR plaklarının 11. ve 12. kolonlarına glukoz standartları eklenir.

Ardından, tüm kuyucuklara 25 µL 1 M sodyum hidroksit eklenir. Son olarak, PCR plakasına 50 µL MBTH reaktifi pipetlenir. Hidrolizatın üçüncü PCR plakasına aktarımı tamamlandıktan sonra derin kuyucuklu plaka saklanır.

PCR plakaları, 60 °C'de 15 dakika boyunca inkübasyon için termosikletörlere aktarılır. Sürecin son adımı, renk oluşumu için reaksiyon karışımının optik plakalara transferidir. İnkübasyonun ardından PCR plakaları termosikletörden çıkarılır.

Aktarılan reaksiyon karışımına yüz mikrolitre yükseltgen reaktif eklenir. Renk oluşumunu kolaylaştırmak için, ön işlem durulamasının ve enzim ilavesinin yaklaşık iki saat sürdüğü sıvı taşıma işlemi 24 saat içinde dört kez gerçekleştirilir. Enzim hidrolizi sekiz saat, şeker tayini ise iki saat daha sürer.

İlk plaka sekiz saat boyunca inkübe edilirken, bir sonraki plaka işleme başlar. Robot kaynaklarının bu şekilde tahsisiyle, salınan indirgen şeker miktarının belirlenmesi için günde 80 örneklik bir çıktı elde edilir. Optik plakalar 620 nanometrede okunur.

Elde edilen sonuçlar, salınan şekerlerin reaksiyon başına saat başına miligram başına nanomol cinsinden miktarını belirlemek için analiz edilir. İzlediğiniz için teşekkürler, umarım bu çalışma biyoyakıtlar konusundaki araştırmalarınıza ilham verir.