Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

Bu video, saf stresin bakteriyel yapışma üzerindeki etkilerini incelemek için bir prosedürü göstermektedir. Nice sirium mens gibi bakteriyel bir patojenle ciddi bir enfeksiyon sırasında, patojen oradaki kan dolaşımına ulaşır, proliferasyonu takiben akan kandan kaynaklanan mekanik stres altındayken konakçı hücrelere yapışır ve kolonize olur, bazı bakteriler yeni bölgeleri ayırır ve kolonize eder ve döngü, konakçı hücrelere bakteri yapışmasını etkileyen faktörleri incelemek için yeniden başlar. Endotel hücreleri, hücrelerin birleşime ulaşmasını sağlamak için tek kullanımlık akış odalarına ve kültüre sokulur.

Floresan bakteriler eklenir ve saf stres deneysel olarak kontrol edilir. Bir şırınga pompası kullanılarak bakterilerin konak hücrelere yapışması ve çoğalması mikroskobik olarak takip edilir. Elde edilen videolar, kesme gerilmesinin endotel kolonizasyonu süreci üzerindeki etkisini belirlemek için analiz edilir.

Bu prosedür, güzel menenjitin patogenezini incelemek için çok yararlı olabilir, ancak patogenez süreci boyunca kayma stresine maruz kalan diğer bakteriler için de kullanılabilir. Bu teknik, özellikle sisteme baloncukların sokulması söz konusu olduğunda biraz zor olabilir, bu da bir sorun olabilir. Bu yüzden bugün prosedürü göstermek, laboratuvarımda çalışan bir doktora öğrencisi olan mega olacak.

Bu videoda açıklanan deneyler, 0,4 milimetre derinliğinde altı adet 17 milimetre uzunluğunda ve 3,8 milimetre genişliğinde kanal içeren tek kullanımlık steril bir plastik slayttan oluşan bir IDI mikro slayt altı 0.4'te kültürlenmiş hücreler kullanılarak gerçekleştirilir. Her kanalın, uve hücrelerini tanıtmak için her iki ucunda birer tane olmak üzere, yem adaptörlü iki erişim portu vardır, kanalların her birine altı hücreli süspansiyona 30 mikrolitre pipet çarpı 10 pipetleyin. Slaytta, hücrelerin 37 derecede üç saat boyunca yapışmasına ve% 5 CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatöre izin verin.

İnkübasyonun ardından 120 mikrolitre daha endo SFM ekleyin. Kuyuları doldurmak için, hücreler yaklaşık 20 saat sonra bir alt birleşik tek tabaka oluşturmalıdır. Bu arada, APL'lere güzel sirium menenjiti ifade eden çizgi GFP, bakteri bir insan patojenidir.

Bu nedenle, bu mikroorganizmanın herhangi bir manipülasyonu, önlük ve eldiven giyen eğitimli personel ile ikinci seviye bir güvenlik tesisinde yapılmalıdır, personelin kullanılan sero grubuna karşı aşılanması önerilir. İşte suş 8 0 1 3. GFP'nin eksprese edilmesi, IPDG ile indüklenebilir bir promotör çizgisinin kontrolü altında kültürlenir.

16 saat boyunca 37 derece Santigrat %5 CO2 inkübatörde Kellogg takviyeleri ve mililitre başına beş mikrogram kloramfenikol içeren GC BPL'lerdeki bakteriler. Memeli hücre kültürleri kurulduktan sonra, kanaldaki konakçı hücrelere bakteriler eklenir. Akış tahliline hazırlanırken, bir aşılama halkası kullanarak, bakterileri Petri kabından toplayın, bunları önceden ısıtılmış, takviye edilmiş endotel hücre kültürü içeren 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.

Orta Endo SFM. Numuneyi aynı ortamda beş mililitrelik bir nihai hacme seyrelterek optik yoğunluğu 600 OD 0.05'e ayarlayın. GFP ekspresyonunu indüklemek için, bir milimolar nihai konsantrasyona IPTG ekleyin ve kültürü 120 dakika inkübe edin.

Nemlendirilmiş 37 santigrat derece %5 CO2 inkübatörde hafif çalkalama ile. Mikro slaytı, numune sıcaklığını 37 santigrat derecede tutmak için ısıtılmış bir platformla donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop aşamasına daha önce hazırlanmış ekili bir endotel hücresi ile yerleştirin. %2 FBS ile takviye edilmiş ön ısıtma endo SFM'yi steril bir cam hoparlöre dökün ve pistonu çekerek 50 mililitrelik şırıngayı doldurun.

Giriş borusu, üç yollu bir durdurma musluğuna bağlanır. Ardından, giriş borusunu şırıngaya takın ve boruyu orta ile doldurmak için pistona bastırın. Sağlanan dik açılı konektörleri kullanarak giriş borusunun diğer ucunu mikro kızağa dikkatlice bağlayın.

Hazneye hava girmesinden kaçının. Şırıngayı pompanın üzerine yerleştirin, ardından bir mililitrelik kesilmiş şırıngayı rezervuar olarak durdurma musluğundaki mevcut yuvaya yerleştirin. Daha sonra çıkış tüpünü kanalın diğer ucuna takın ve şırınga pistonunu hazne çıkışından yaklaşık bir santimetre mesafeye kadar iterek kanalı dikkatlice orta ile doldurun.

Bakteriyel OD 600'ü ölçün ve daha önce olduğu gibi %2 FBS içeren 0,15 ve endo SFM'ye ayarlayın, bakteri agregatlarını bozmak için numuneyi kuvvetlice girdaplayın. Daha sonra, tek kullanımlık bir plastik mera pipeti kullanarak,% 2 FBS ortamı ile desteklenmiş 100 mikrolitre endos fm'yi rezervuara aktarın. Daha sonra girdap çözeltisinin üstünden 100 mikrolitre bakteri çözeltisi aspire edin ve rezervuara ekleyin.

Muslukları dikkatlice çevirin, kontrollü paylaşım stres seviyesinin varlığında yapışmanın ilerlemesine izin vermek için bakterileri mikro slaytın haznesine enjekte edin. Şırınga pompasını saatte 3,5 mililitre kullanarak 15 dakika boyunca %2 FBS içeren endo SFM'yi hazneye sokun. Bu video 60 kat hızlandırıldı.

Gerçek süre 10 dakikadır. Bu adımdan sonra, bakterilerin çeşitli koşullar altında konakçı hücrelere yapışması ve ayrılması da değerlendirilebilir ve videonun ilerleyen bölümlerinde açıklanabilir. Tek tek bakterilerin konakçı hücrelere ilk yapışmasını ölçmek için, sıvı hala dolaşırken 15 dakikalık akıştan sonra görüntü almaya başlayın, görüntülenen alan başına ortalama yapışkan bakteri sayısını belirlemek için 10 rastgele alanın görüntülerini elde edin.

Görüntü günü yazılımını açarak başlayın ve analiz edilecek görüntüyü açın. Görüntü menüsüne tıklayarak ve seçerek başlayın. Parlaklığı, kontrastı ayarlayın.

İmleci hareket ettirerek yoğunluk seviyelerini ayarlayarak arka plan üzerinde tek tek yapışan floresan bakterilerin görselleştirmesini optimize edin. Ardından eklentide, hücre sayacı menüsünü analiz edin. Hücre sayacı aracını açın, görüntüyü başlatın, nesneyi seçin, her bir bakteriyi yazın ve tıklayın.

Pencerede toplam bakteri sayısı görünür. Son olarak, tek tek yapışkan bakterilerin akışa karşı direncini ölçmek için alan başına ortalama yapışkan bakteri sayısını ölçmek için her görüntünün verilerini excel ve ortalamaya aktarın. İlk 15 dakikalık akış programından sonra, şırınga pompası, beş dakika boyunca santimetre kare başına üç ila 100 kuruş arasında değişen kesme gerilimi oluşturacak şekilde ayarlanır.

Beş dakikanın sonunda, akışı durdurun ve alan başına kalan ortalama bakteri sayısını belirlemek için daha önce olduğu gibi 10 rastgele alan alın ve analiz edin. İlk 15 dakikalık akışın ardından, şırınga pompasını seçilen kesme gerilimine ayarlayın. Birkaç saat akmasına izin verin ve görüntüleri her beş dakikada bir kare hızında kaydedin.

İdeal olarak, mikroskop motorlu bir XY platformu ile donatılmışsa birkaç pozisyon takip edilebilir. Video mikroskobunu takiben, şırınga pompasını kapatarak katıksız stresi durdurun. Hemen iki ila üç ek görüntü alın ve ardından yazılımdaki görüntü alma sırasını durdurun.

Bakteriyel çoğalmanın bir örneği burada görülebilir. Son olarak, görüntüleri analiz etmek için, görüntüleri ikiliye dönüştürmek için görüntü J'nin görüntü ayarlama eşiği menüsünü kullanın. Ardından analiz menüsünde ölçümü ayarla altında, alan ölçümünü seçin.

Ardından, kolonilerin boyutunu otomatik olarak belirlemek için parçacık analiz aracını kullanın. Bu noktada akışın sürdürülüp sürdürülmediğine bakılmaksızın, beş ila yedi saat sonra hücresel yüzeyde büyük mikro koloniler oluşur. Önce mikro koloninin akışa karşı direncini ölçmek için, faz kontrastı ile her iki hücrenin ve GFP floresansı ile bakterilerin iki ila üç görüntüsünü elde edin.

Beş dakika boyunca yüksek kesme gerilimi uygulayın ve her beş saniyede bir karede floresan görüntüler çekin. Şırınga pompasını kapatarak kesme gerilimini durdurun. İki ila üç ek görüntü elde edin ve ardından bir kaplama tahlili için ortamı toplamak üzere yazılımda görüntü alma sırasını durdurun.

İlk olarak, kanalı boşaltmamaya dikkat ederek çıkış borusunu çıkarın. Kuyuları doldurmak için önceden ısıtılmış taze ortam ekleyin. Daha sonra giriş borusunu çıkarın ve kalan ortamı bir mikro pipet ile toplayın ve bir mikro santrifüj tüpüne aktarın Kalan ortamı kanaldan çıkarmak için, kanala PBS'ye 120 mikrolitre ekleyerek mikro sürgüyü iki kez durulayın.

Slaytı iki kez eğin ve ortamı atın. Enfekte olmuş hücreleri toplamak için, mikro slayta 50 mikrolitre tripsin EDTA ekleyin ve bunları kanaldan ayırmak için 37 derecede beş dakika inkübe edin ve bu ayrılmış numuneyi önceki adımda toplanan bir süspansiyon ile karıştırın. PBS plakasında 10 mikrolitrelik fraksiyonlarda seri seyreltme gerçekleştirdikten sonra, GCB agri plakalarına yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derece %5 CO2 ile üç kez inkübe edin.

Ertesi gün, mikro kolonilerden bakteri ayrılmasını değerlendirmek için koloni oluşturan birimlerin sayısını belirleyin. Akış odasındaki hücreleri daha önce olduğu gibi 30 dakika sonra saatte 3,5 mililitre düşük akışta enfekte edin, akışı iki dakikalık bir süre boyunca dakikada beş mililitreye çıkararak bağlanmamış bakterileri çıkarın ve ardından saatte 3,5 mililitre düşük akışa geri dönün ve enfeksiyonun iki saat devam etmesine izin verin. Daha sonra her saat, dört saat boyunca bir mikro santrifüj tüpünde akış odasından çıkan bir damla ortam toplayın.

Tüm numuneler toplandıktan sonra, daha önce olduğu gibi koloni oluşturan birimlerin sayısını belirleyin. Bu, bakterilerin hücresel yüzeye ilk yapışmasının grafiksel bir temsilidir. Grafikteki her çizgi, zamanın bir fonksiyonu olarak belirli bir alana bağlı kümülatif bakteri sayısını temsil eder.

Üç alan için değerler, hücresel yüzeyde çoğalmadan sonra beklenen alandan alana varyasyon hakkında bir fikir vermek için belirtilmiştir. Mikro kolonilerin mekanik direnci, kayma gerilme seviyesinin santimetre kare başına 10 dines'e çıkarılmasıyla test edildi, ancak tip mikro koloniler dirençli iken, hap v mutantının oluşturduğu mikro koloniler akış artışı ile bozuldu. Bu mutant, mikro koloniler altında plazma zarının yeniden şekillenmesini indükleyemez ve bu nedenle, gelişiminden sonra kesme stresini artırmaya karşı daha hassastır.

Bu teknik, bulaşıcı hastalık alanındaki diğer araştırmacıların, kayma stresinin çeşitli patojenlerin farklı hücre tipleriyle etkileşimi üzerindeki etkisini keşfetmelerinin yolunu açtı. İnsan patojenleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman ikinci veya üçüncü seviye önlemler gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.