Name: Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Keşfedin, akış odaları kullanarak endotelyal hücrelere bakteriyel yapışmayı inceleyen bu yöntemi. Neisseria meningitidis gibi patojenlerin fizyolojik koşullardaki davranışlarını anlamak için değerli bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar prosedürünün başlangıç ​​ayarı için Emilie Mairey ve Emmanuel Donnadieu teşekkür etmek istiyorum.

1. İnsan konak hücre ve bakteri kültürü <ol><li> Geçit 1 ve% 5 (v / v) CO 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatör 37 ° 9 arasında Kültür HUVECs. Passage hücreleri tek akış odaları (μ-Slaytlar VI) 75 cm 2 kültür şişeler ve deneysel kültürler bakım kültürleri sağlamak için tripsin / EDTA ile% 80 izdiham yaklaşım. </li><li> Geçişli olması şişeler, orta Çekme, 10 ml PBS ile hücrelerin yıkamak çekilme ve 1,5 ml tripsin / EDTA ile değiştirin. Hücreler 37 ° C inkübatör bir hücre kültürü az 5 dakika ayırmak için izin verin </li><li> Hücrelerin, hücre kültür ortamı 10 ml, 15 ml toplama tüpüne toplayın. Oda sıcaklığında 5 dakika santrifüj Pelet hücreleri (200 gr),. Endo-SFM 4 ml% 10 ile desteklenen hücreler Askıya Alma (v / v) FBS ve üreticinin talimatlarına göre, bir Malassez odasında onları saymak. </li><li> Kanal (3x10 toplam 4) içine 30 ml süspansiyon başına 1x10 6 HUVEC hücrelerinin ul tanıtmak ve hücrelerin 3 saat 37 ° uymak ° nemlendirilmiş bir inkübatör,% 5 (v / v) CO 2 bir atmosfer sağlar . Kuyuları doldurmak için ek bir hacmi, Endo-SFM 120 ul ekleyin. Hücreler bir akışkan tek tabaka (Şekil 2) oluşturmalıdır. </li><li> N. büyütün Kellogg'un takviyeleri ve 37 ° 5 mg / ml 'lik kloramfenikol, °% 5 içeren bir nemli bir atmosfer C (v / içeren GCB agar plakaları GFP (bir IPTG-indüklenebilir promotör kontrolü altında bu durumda gerginlik 8013 ifade GFP), ifade meningitidis v) 16 saat boyunca CO 2. </li></ol> 2. Bireysel bakteriler ilk yapışma hücreleri ev sahipliği yapacak <ol><li> Önceden ısıtılmış Endo-SFM 37 120 dakika için% 10 (v / v) FBS ve inkübe içeren ° C% 5 (v / içeren nemli bir atmosferde bir OD600 0.05 GCB agar plaklarına yetişen bakteri konsantrasyonu ayarlayın. v) altında CO 2, nazik sallayarak (130 rpm). Neden bütün kuluçka dönemi için kültür ortamı içine 1 mM IPTG ekleyerek GFP ifade. </li><li> 37 örnek sıcaklığını korumak için ısıtmalı bir platform ° C ile donatılmış bir inverted mikroskop aşamasında tek μ-Slayt yerleştirin. </li><li> % 2 ile desteklenmiş önceden ısıtılmış Endo-SFM (v / v) FBS steril bir cam behere dökün ve bu ortamda 50 ml steril bir şırınga doldurun. "Giriş" tüp şırıngaya takın ve orta getirerek doldurun. </li><li> Odasına hava tanıtan önlemek için, bakım, μ-Slide "giriş" boru bağlayın. Sonra, dikkatli bir şekilde yapıştırmayın, diğer ucunu da "çıkış" tüp ve "çıkış" oda yaklaşık 1 cm mesafe orta kanal doldurun. </li><li> Bakteriyel OD600 ölçün ve 0.15 ila% 2 (v / v) FBS içeren Endo-SFM ayarlayabilirsiniz. Bireysel bakteriler bakmak için, herhangi bir agrega bakteriyel örnek dinç vorteks bozulacak gerekir. </li><li> Endo-SFM Yeri 100 ul rezervuar içine% 2 (v / v) FBS orta ile desteklenmiş ve 100 ul kalan bakteri agrega örnekleme önlemek için vortekslenmiş bir çözüm yukarıdan alınan bakteri çözüm ekleyin. </li><li> Μ-Slayt 200 ul hacmi odasına bakteri enjekte stopcock çevirerek dikkatlice tanıtmak. </li><li> % 2 içeren Endo-SFM (v / v) FBS, bakımı, 37 ° C ısıtılmış platform, 0.044 dynes / cm 2 15 dakika yapışması ile uyumlu bir kayma gerilmesi ile bir şırınga pompası kullanarak odasına tanıtın </li></ol> Video 1 veya 3 rakam örneği için Bkz. Bu adımdan sonra, bölüm 3, 4 veya 6 ya kadar hareket ettirin. 3. Konak hücreleri için bireysel bakterilerin ilk yapışma Niceleme <ol><li> 15 dakika boyunca ilk yapışma sonra sıvı hala dolaşımda iken, rastgele on alanları görüntüler elde. </li><li> ImageJ yazılım 8, adherant bakterilerin alan başına ortalama sayısı erişmek için kullanarak elde edilen görüntüleri analiz eder. Aşağıdaki şekilde yapılır: her şeyden önce, her bir görüntü hücrelerin arka plan en aza indirerek, bireysel kalarak floresan bakteri vurgulamak için "Image" menüsünde bulunan "Eşik" penceresini kullanarak eşiklenir. Sonra, her bir bakteri, Plug-In "Hücre Sayacı" (kullanarak sayılır <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> ). Her görüntü için verileri bir Excel tablo ve alan başına yapışık bakterilerin ortalama sayısı ölçmek için ortalaması alınır. </li></ol> 4. Konak hücreleri için yapışık bireysel bakterilerin akış direnci Ölçüm <ol><li> Programı şırınga pompası, 3, 100 dynes / 5 dakika boyunca cm 2 arasında değişen kayma stres oluşturmak için set- up. </li><li> 5 dakika sonunda, adım 3.1 'de açıklandığı gibi rastgele seçilen on alanları kazanmak, ancak akışı ile pr durduedinimi IOR. </li><li> Adım 3.2 'de açıklandığı gibi elde edilen görüntüleri analiz ve alan başına kalan bakteri sayısı ortalaması ölçmek. </li></ol> 5. Microcolony için izole bir yapışkan bakteri büyüme Ölçüm <ol><li> Endo-SFM% 10 (v / v) FBS, bakımı, 37 ° C ısıtılmış platformu ile, birkaç saat için seçilen kayma gerilmesi ile bir şırınga pompası kullanılarak odasına içeren tanıtın Her 5 dakikada bir kare gerçek zamanlı video mikroskopi için kayıt görüntüler. </li><li> Video mikroskopi ardından, şırınga pompası kapatarak kayma gerilmesi durdurmak, 2-3 ek görüntüleri kazanmak ve daha sonra yazılım üzerinde görüntü elde etme sırası durdurmak. Bakteri oluşumunu bir örnek video 2 görülebilir. </li></ol> 6. Yapışık bakteriyel mikrokoloniler akış direnci ölçümü <ol><li> Hücresel yüzey oluşumuna büyük mikrokoloniler sonra (step5.2) akış uygulamadan önce 2-3 hücreler görüntüleri (faz kontrast) ve bakteri (GFP-floresans) kazanmak. Deney geri kalanı için, satın alma protokolü sadece floresan izleyecektir. </li><li> Her 5 saniyede bir kare 5 dakika (300-100 dynes / cm 2) ve kayıt görüntüleri için yüksek kayma gerilmesi uygulanması. </li><li> Kayma gerilmesi şırınga pompası kapatarak durdurun, 2-3 ek görüntüler elde edin ve sonra yazılım üzerinde görüntü elde etme sırası durdurmak. </li><li> Sonra, "çıkış" tüp ilk çıkarın ve dikkatli bir şekilde, kanal boşalmasını önlemek için ve ardından "giriş" tüp çıkarmadan önce kuyuları doldurmak için, önceden ısıtılmış taze orta ekleyin. </li><li> Kantitatif bakteriyel direnç kayma stres etkisini belirlemek için, aşağıdaki gibi bir kaplama tahlil yapılabilir: kalan orta toplamak ve μ-Slayt kanal (hem yıkar kalan orta kaldırır 120 ul, PBS ile iki kez yıkayın Ayrıca toplanan). </li><li> 37 ° 'de 5 dakika süreyle 50 ul tripsin / EDTA ilavesi ile enfekte olan hücreleri ayırın ve bu müstakil örnek önceki adımda toplanan süspansiyon ile karıştırın. </li><li> PBS ve plaka GCB agar plakları üzerine üç nüsha halinde 10 ul fraksiyonu, seri dilüsyonları, 37 plaka inkübasyondan sonra, ertesi gün koloni oluşturan birim (CFU) sayısı belirlemek amacıyla gerçekleştir ° bir kuluçka C % 5 (v / v) CO 2. </li></ol> Videolar 3 ve 4 pilV mutant vahşi tip suşu karşılaştırın. 7. Mikrokoloniler gelen Bakteriyel dekolmanı <ol><li> 2.1 ve 2.8 için gerekli adımları tekrarlayarak akış odasında hücreleri enfekte ve enfeksiyon 30 dakika boyunca devam etmek için izin verir. </li><li> 2 dakikalık bir süre için 10 dynes / cm 2 akımını artırarak bağlanmamış bakteri çıkarın ve enfeksiyon 2s için devam etmek için izin verir. </li><li> 0.15 dynes / cm 2 akış azaltın. </li><li> Her saat, orta akışını odasına çıkan bir damla toplamak. </li><li> GCB agar plaklarına örnekleri ve plaka bunları seri dilüsyonları gerçekleştirin. </li><li> 37 plaka inkübasyondan sonra ertesi gün sayısı koloni oluşturan birim (CFU), ° C,% 5 (v / v), CO 2 ile bir inkübatör belirleyin . </li></ol> 8. Temsilcisi sonuçları <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: Farklı adımları prosedürü akış varlığı gözlenen ve ölçülebilir bir hücresel tek tabaka. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: (kayma gerilmesi yokluğu) bir deney başında akışını odasında Endotel hücre tek tabaka. Hakkında 50 endotel hücreleri, bir alt-konfluent tek tabaka düzenlenmektedir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3: hücre yüzeyinde bakterilerin ilk yapışma grafik gösterimi. Üç alanlar için Değerler (0044 dynes / cm 2) bekleniyor alan-alan varyasyon bir fikir vermek için gösterilir. Video 1 (0044 dynes / cm 2) zamanın bir fonksiyonu olarak hücresel tek tabaka bakterilerin ilk yapışma Görselleştirme. GFP-ifade bakteriler akan orta yönünü takip ediyoruz. Film 60 kat hızlanır, gerçek video süresi 10 dakikadır. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">Videoyu izlemek için buraya tıklayın.</a> Video 2 ilk yapışma bakteri sonra 7 saatlik bir süre için (1000 kat hızlandırılmış) hücre yüzeyinde tomurcuklanmaya izin verildi . <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">Videoyu izlemek için buraya tıklayın.</a> Video 3 Silahların Yayılmasının Önlenmesi sonra hücresel yüzey mekanikmikrokoloniler al direnç ama vahşi tip mikrokoloniler dayanıklı hızlandırılmış 60 kat, 5 dakika 10 dynes / cm 2 kesme stres düzeyini artırarak tarafından test edildi . <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">Videoyu izlemek için buraya tıklayın.</a> PilV mutant tarafından oluşturulan video 4 mikrokoloniler akışını artırmak (10 dynes / cm 2) tarafından bozulur. Bu mutant mikrokoloniler altında plazma zarı yeniden şekillenme ikna etmek için başarısız olur ve böylece daha artmış shear stresin (video 60 kat hızlanır) 5 son derece hassas. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">Videoyu izlemek için buraya tıklayın.</a>

<ol><li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+Principles+of+Vascular+Beds%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Design Principles of Vascular Beds.</a> Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).</li>
<li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16, 31-42 (2009).</li>
<li>Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+cells+sedimenting+on+a+solid+surface+in+a+laminar+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow.</a> Biophys J. 61, 204-215 (1992).</li>
<li>Mikaty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).</li>
<li>Chamot-Rooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modification+of+pili+upon+cell+contact+triggers+N.+meningitidis+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination.</a> Science. 331, 778-782 (2011).</li>
<li>Soyer, M., Dumínil, G. Bacterial adhesion under shear stress. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSoyer%2C+M+%22Neisseria+meningitidis%3A+Methods+and+Protocols+%28Methods+in+Molecular+Biology%29%22">Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)</a>. Christodoulides, M. , Humana Press Inc. New York. (2011).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li>
<li>Tchesnokova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-enhanced+binding+of+intestinal+colonization+factor+antigen+I+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).</li>
<li>Konto-Ghiorghi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+pilus+in+adherence+to+epithelial+cells+and+biofilm+formation+in+Streptococcus+agalactiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae.</a> PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Kayma gerilmesi ve genellikle biyoloji mekanik yönlerini önemi giderek kabul edilmektedir. Örneğin lenfositler yapışma ve damar duvarının üzerinde yuvarlanan süreci proteinlerin selektin ailesi son derece adapte yapıştırıcı özellikleri, bu süreç içinde kayma gerilmesi tanıtan kabul edilmiştir. Gram-negatif bakteriler Neisseria meningitidis yukarıda açıklanan prosedür uygulandı ancak geniş bir yelpazede patojenlerin uygulanabilir olmalıdır. Kayma gerilmesi önemi diğer patojenler ve diğer enfeksiyon siteleri için de gösterilmiştir. Bakteriyel yapışma kayma gerilmesi klimalı üropatojen Escherichia coli (UPEC) 9 bulundu FimH adhesin çalışma ile tarif edilmiştir. Selektinler benzer şekilde, FimH ve konak hücre reseptör arasındaki etkileşimi kesme bağlı mekanik kuvvetlerin 9 ve enterotoksijenik E.coli CfaE adhesin güçlendirilmelidir gösterildi bağımlı bir kayma ile bağırsak epitel hücrelerine yapışma aracılık etmek de bildirilmiştir mekanizması 10. Streptococcus agalactiae pili 11 akış koşulları altında epitel hücreleri bu patojen bağlılık için gerekli olduğunu bu bölümde açıklanan laminer akış odasına tahlil protokol kullanarak bildirdi. Bu çalışmalar bizim akışı odasına tahlil kayma gerilmesi koşulları altında konak hücre-patojen etkileşimleri araştırmak için faydalı bir araç olduğunu teyit etmektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> μ-Slide VI 0.4 akış kiti </td><td> IBIDI </td><td> 80606 </td></tr><tr><td> Şırınga Plastipak 50 ml Luer-Lock </td><td> Becton Dickinson </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Tygon Boru R3603 3.2 x 4.8mm </td><td> Fisher-Bilimsel </td><td> R3603 </td></tr><tr><td> Erkek luer 3-yollu valfli, 2 dişi luer </td><td> Bio-Rad </td><td> 7328103 </td></tr><tr><td> Şırınga pompası </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td> Ters mikroskop Nikon </td><td> Nikon </td><td> Eclipse T i </td></tr><tr><td> CCD kamera </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA 285 CCD veya ORCA 3-CCD </td></tr><tr><td> ImageJ yazılımı </td><td> NIH </td><td> SORULAR VE CEVAPLAR ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) </td></tr></tbody></table>

bakteriyel yapışma Çalışma kesme stres tanıtımı

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Bakteriyel enfeksiyonlar sırasında patojen ve ev sahibi arasındaki etkileşimlerin bir dizi oluşur. Patogenezinde konak hücre yüzeyine bakteriyel yapışma genellikle ilk ve belirleyici bir adımdır. Deneysel yapışma çoğunlukla statik koşullarda eğitim olmasına rağmen yapışma aslında akan sıvı varlığında gerçekleşir. Bakteri ve ev sahibi arasında ilk karşılaştığında genellikle mukus epitel hücrelerinin yüzeyi boyunca akan mukozal düzeyde, ağız, akciğer, bağırsak, göz, vs meydana gelir. Daha sonra enfeksiyon, patojenlerin bazen hayatı tehdit eden septisemi, sepsis ve menenjit gibi hastalıklara neden kan dolaşımını erişmek. Bu enfeksiyonların bir belirleyici özelliği, bu patojenlerin kan dolaşan varlığı endotel hücreleri ile etkileşim yeteneği. Patojen mekanik bir güç üretir, çünkü, örneğin sıvı, mukus veya kan akan varlığı, yapışma belirler. Sıvı bir akan etkisi karakterize etmek için genellikle dynes / cm 2 olarak ifade sabit bir duvarına yakın hareket eden bir sıvı, birim alan başına sarf teğet güçtür kayma gerilmesi, kavramı ifade eder. Kayma gerilmesi Şiddetleri farklı damarları türüne göre büyük farklılıklar gösterir, boyut, organ, konumu vb (0-100 dynes / cm 2). Kılcal damarlarda kan dolaşımı çok düşük kayma gerilmesi değerlerine ulaşmak ve hatta geçici olarak birkaç dakika 1 birkaç saniye arasında değişen dönemlerde durdurabilirsiniz. Arteriollerde spektrum kayma gerilmesi Diğer taraftan 100 dynes / cm 2 2 ulaşabilirsiniz. Örneğin gibi farklı biyolojik süreçlerin kayma gerilmesi etkisi açıkça lökositlerin endotel 3 ile etkileşim sırasında kanıtlanmıştır. Bakteriyel yapışma sürecinde bu mekanik parametre dikkate almak için tek bir akış kullanımı odasının 4 dayalı deneysel bir prosedür avantaj aldı. Konak hücrelerine akış odasında yetiştirilen ve floresan bakterilerin bir şırınga pompası tarafından kontrol akış tanıtıldı. Biz başlangıçta bakteriyel patojen Neisseria meningitidis, septisemi ve menenjit sorumlu bir Gram-negatif bakteri soruşturma duruldu. Bize bakterilerin yeteneği üzerinde kayma stres üzerindeki etkilerini incelemek için izin prosedürü burada açıklanan hücre yüzeyinde 5 prolifere hücreler 1, uymak ve yeni siteler 6 (Şekil 1) kolonize ayırmak için. Tamamlayıcı teknik bilgiler referans 7 bulunabilir. Burada sunulan Kesme gerilmesi değerleri, literatürde bulunan değerleri temsil etmek için önceki deneyimi 1 ve dayalı seçildi . Protokol geniş bir yelpazede çalışma hedeflerine bağlı olarak belirli ayarlamalar ile patojenler için geçerli olmalıdır.

Enfeksiyon süreci boyunca, önemli bir adım patojenlerin konak hücrelerine yapışma. Çoğu durumda bu yapışma adım akan sıvı tarafından üretilen mekanik stres varlığında oluşur. Biz kayma gerilmesi bakteriyel yapışma çalışmada önemli bir parametre olarak tanıtan bir tekniktir açıklar.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

Bakteriyel enfeksiyonlar sırasında, patojen ile konakçısı arasında bir dizi etkileşim meydana gelir. Bakterilerin konak hücre yüzeyine adezyonu genellikle ...

Bu video, kayma stresinin bakteriyel adhezyon üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılan bir prosedürü göstermektedir. Neisseria meningitidis gibi bakteriyel bir patojenle seyreden şiddetli bir enfeksiyon sırasında patojen kan dolaşımına ulaşır; burada, kan akışından kaynaklanan mekanik stres altındayken konak hücrelere tutunur ve bunları kolonize eder. Proliferasyonun ardından bazı bakteriler ayrılır ve yeni bölgeleri kolonize eder, böylece döngü yeniden başlar. Bakterilerin konak hücrelere adhezyonunu etkileyen faktörleri incelemek amacıyla, endotel hücreler tek kullanımlık akış odalarına yerleştirilir ve hücrelerin konfluence seviyesine ulaşması için kültüre edilir.Floresan bakteriler eklenir ve kayma gerilmesi deneysel olarak kontrol edilir. Bir şırınga pompası kullanılarak bakterilerin konak hücrelere adezyonu ve proliferasyonu mikroskobik olarak takip edilir. Elde edilen videolar, kayma gerilmesinin endotelyum kolonizasyonu süreci üzerindeki etkisini belirlemek için analiz edilir.Bu prosedür, nice menenjitinin patogenezini incelemek için oldukça faydalı olabilir; ancak patogenez süreci boyunca makaslama stresine maruz kalan diğer bakteriler için de kullanılabilir. Bu teknik, özellikle sisteme hava kabarcıklarının girmesi durumunda -ki bu bir sorun teşkil edebilir- uygulaması biraz zor olabilir. Bu nedenle, prosedür bugün laboratuvarımda çalışan bir doktora öğrencisi olan Mega tarafından demonstre edilecektir.Bu videoda açıklanan deneyler, 0,4 mm derinliğinde, 17 mm uzunluğunda ve 3,8 mm genişliğinde altı kanaldan oluşan tek kullanımlık steril plastik bir lam içeren IDI micro slide six 0.4 kullanılarak kültürlenen hücrelerle gerçekleştirilmiştir. Her kanalın her iki ucunda, uve hücrelerini yerleştirmek için lure adaptörlü iki erişim portu bulunur; her bir kanala 1 $\times$ 10⁶ hücre süspansiyonundan 30 µL pipetleyin. Hücrelerin, 37 °C sıcaklıkta, %5 CO2 atmosferli nemlendirilmiş bir inkübatörde üç saat boyunca lama tutunmasını sağlayın.İnkübasyonun ardından, 120 µL ek endo SFM ilave edin. Kuyucukları doldurmak için hücrelerin yaklaşık 20 saat sonra subkonflüen bir monolayer oluşturması gerekir. Bu sırada, GFP eksprese eden Neisseria meningitidis'i APL'lere ekin; bu bakteri bir insan patojenidir.Bu nedenle, bu mikroorganizma ile yapılacak her türlü işlem, önlük ve eldiven giymiş eğitimli personel eşliğinde, iki. seviye güvenlik tesisinde gerçekleştirilmelidir; personelin kullanılan serogrupa karşı aşılanması önerilir. İşte GFP ifade eden ve IPDG indüklenebilir promotör kontrolü altında kültüre edilen 8 0 1 3 suşu.Kellogg takviyeleri ve mililitre başına beş mikrogram kloramphenikol içeren GC BPL'lerdeki bakteriler, 37 °C sıcaklıkta %5CO2 inkübatöründe 16 saat boyunca inkübe edilir. Memeli hücre kültürleri kurulduktan sonra, kanaldaki konak hücrelere bakteriler eklenir. Akış analizi hazırlığı için, bir ekim halkası kullanarak bakterileri Petri kabından toplayın ve önceden ısıtılmış, takviyeli endotel hücre kültürü içeren 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.Medium Endo SFM. Örneği aynı ortamda beş mililitre son hacme seyrelterek optik yoğunluğu 0,05 OD 600 değerine ayarlayın. GFP ekspresyonunu indüklemek için, bir milimolar son konsantrasyon olacak şekilde IPTG ekleyin ve kültürü 120 dakika boyunca inkübe edin.Hafif çalkalamalı, nemlendirilmiş, 37 °C, %5CO2'li bir inkübatörde. Daha önce hazırlanmış kültüre edilmiş endotel hücreleri içeren mikro lamı, numune sıcaklığını 37 °C'de tutmak için ısıtmalı platformla donatılmış bir ters mikroskobun tablasına yerleştirin. %2FBS ile desteklenmiş, önceden ısıtılmış endo SFM'yi steril bir cam behere dökün ve pistonu çekerek 50 mL'lik şırıngayı doldurun.Giriş borusu, üç yollu bir musluğa bağlanır. Ardından, giriş borusunu şırıngaya takın ve boruyu ortamla doldurmak için pistonu bastırın. Giriş borusunun diğer ucunu, sağlanan dik açılı konnektörleri kullanarak mikro lamın ucuna dikkatlice bağlayın.Hafızaya hava girmesinden kaçının. Şırıngayı pompaya yerleştirin, ardından rezervuar olarak kullanmak üzere kesilmiş bir mililitrelik şırıngayı musluk üzerindeki uygun yuvaya yerleştirin. Daha sonra çıkış tüpünü kanalın diğer ucuna sabitleyin ve şırınga pistonunu iterek kanalı, hazne çıkışından yaklaşık bir santimetre mesafeye kadar besiyeri ile dikkatlice doldurun.Bakteriyel OD 600 değerini ölçün ve daha önce yapıldığı gibi %2 FBS içeren endo SFM ile 0,15'e ayarlayın; bakteriyel agregaları dağıtmak için örneği kuvvetlice vorteksleyin. Ardından, tek kullanımlık plastik bir pastör pipeti kullanarak, %2 FBS ile takviye edilmiş 100 mikrolitre endos fm'yi rezervuara aktarın. Sonra, vortekslenen solüsyonun üst kısmından 100 mikrolitre bakteriyel solüsyon aspire edin ve bunu rezervuara ekleyin.Musluğu dikkatlice çevirin, bakterileri kontrollü kayma gerilimi seviyesinde yapışmanın gerçekleşmesini sağlamak için mikro lamın haznesine enjekte edin. Şırınga pompasını kullanarak, saatte 3,5 mililitre hızla 15 dakika boyunca hazneye %2 FBS içeren endo SFM ekleyin. Bu video 60 kat hızlandırılmıştır.Gerçek süre 10 dakikadır. Bu adımın ardından, bakterilerin çeşitli koşullar altında konak hücrelere tutunması ve ayrılması değerlendirilebilir; bu süreç videonun ilerleyen bölümlerinde açıklanmaktadır. Tekil bakterilerin konak hücrelere ilk tutunmasını nicelleştirmek için, sıvı hâlâ sirkülasyon halindeyken, akış başladıktan 15 dakika sonra görüntü almaya başlayın; görüntülenen alan başına ortalama tutunan bakteri sayısını belirlemek için 10 rastgele alanın görüntüsünü alın.ImageJ yazılımını açarak başlayın ve analiz edilecek görüntüyü yükleyin. Görüntü (image) menüsüne tıklayıp parlaklık ve kontrast ayarla (adjust brightness contrast) seçeneğini seçerek işleme başlayın.İmleci hareket ettirerek yoğunluk seviyelerini ayarlayıp, arka plan üzerindeki tekil yapışık floresan bakterilerin görselleştirmesini optimize edin. Ardından eklentideki analyze cell counter menüsüne gidin. Hücre sayma aracını açın, görüntüyü başlatın, nesne türünü seçin ve her bir tekil bakterinin üzerine tıklayın.Toplam bakteri sayısı pencerede görünür. Son olarak, her görüntü için verileri Excel'e aktarın ve her alandaki ortalama adherent bakteri sayısını belirlemek için ortalamasını alarak, tekil adherent bakterilerin akışa karşı direncini ölçün. İlk 15 dakikalık akış programının ardından, şırınga pompası beş dakika boyunca santimetrekare başına üç ile 100 dyn arasında değişen kayma gerilmesi oluşturacak şekilde ayarlanır.Beş dakikanın sonunda akışı durdurun ve alan başına kalan ortalama bakteri sayısını belirlemek için daha önce olduğu gibi 10 rastgele alanı elde edip analiz edin. İlk 15 dakikalık akışın ardından, şırınga pompasını seçilen kayma gerilimine göre ayarlayın. Akışın birkaç saat boyunca sürmesine izin verin ve her beş dakikada bir kare olacak şekilde görüntüler kaydedin.İdeal koşullarda, mikroskop motorlu bir XY platformuna sahipse birkaç farklı konum takip edilebilir. Video mikroskobisini takiben, şırınga pompasını kapatarak kayma stresini durdurun. Hemen ardından iki ila üç ek görüntü alın ve ardından yazılımdaki görüntü alma dizisini durdurun.Bakteriyel proliferasyon örneği burada görülebilir. Son olarak, görüntüleri analiz etmek için, görüntüleri binary (ikili) formata dönüştürmek amacıyla ImageJ'in "image adjust threshold" menüsünü kullanın. Ardından, "analyze" menüsündeki "set measurement" kısmından alan ölçümünü seçin.Ardından, kolonilerin boyutunu otomatik olarak belirlemek için parçacık analiz aracını kullanın. Akış bu noktada sürdürülüp sürdürülmediğine bakılmaksızın, beş ila yedi saat sonra hücresel yüzeyde büyük mikro koloniler oluşur. Mikro kolonilerin akışa karşı direncini ölçmek için öncelikle, her iki hücrenin faz kontrast görüntüleri ile bakterilerin GFP floresans görüntülerini iki ila üç adet olacak şekilde elde edin.Beş dakika boyunca yüksek kayma gerilimi uygulayın ve her beş saniyede bir kare olacak şekilde floresan görüntüler alın. Şırınga pompasını kapatarak kayma gerilimini durdurun. İki ila üç ek görüntü daha edinin ve ardından plaklama analizi için besiyerini toplamak üzere yazılımdaki görüntüleme sekansını durdurun.İlk olarak, kanalı boşaltmamaya dikkat ederek çıkış tüpünü çıkarın. Kuyucukları doldurmak için önceden ısıtılmış taze besiyeri ekleyin. Ardından giriş tüpünü çıkarın ve kalan besiyerini bir mikro pipetle toplayıp bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Kanaldaki tüm kalıntı besiyerini uzaklaştırmak için, kanala 120 µL PBS ekleyerek mikro lamı iki kez durulayın.Lam iki kez eğilerek besiyeri dökülür. Enfekte hücreleri toplamak için, mikro lama 50 µL tripsin EDTA eklenir ve hücrelerin kanaldan ayrılması için 37 °C'de beş dakika inkübe edilir; ardından bu ayrıştırılmış örnek, önceki adımda toplanan süspansiyonla karıştırılır. PBS içinde seri dilüsyon yapıldıktan sonra, 10 µL'lik fraksiyonlar GCB agar plaklarına ekilir ve üç paralel örnek halinde 37 °C'de %5 CO2 ortamında gece boyunca inkübe edilir.Ertesi gün, mikro kolonilerden bakteriyel kopmayı değerlendirmek için koloni oluşturan birim sayısını belirleyin. Akış odasındaki hücreleri daha önce olduğu gibi, 3,5 ml/saat düşük akış hızında enfekte edin; 30 dakika sonra, akışı iki dakika boyunca dakikada beş mililitreye çıkararak bağlanmamış bakterileri uzaklaştırın ve ardından tekrar 3,5 ml/saat düşük akış hızına dönerek enfeksiyonun iki saat boyunca devam etmesine izin verin. Daha sonra, dört saat boyunca her saat başı, akış odasından çıkan bir damla besiyerini bir mikro santrifüj tüpüne toplayın.Tüm örnekler toplandıktan sonra, daha önce olduğu gibi koloni oluşturan birim sayısını belirleyin. Bu, bakterilerin hücresel yüzeye başlangıç adezyonunun grafiksel bir gösterimidir. Grafikteki her bir çizgi, belirli bir alanda bağlanan bakterilerin toplam sayısını zamana bağlı olarak temsil eder.Hücresel yüzeydeki proliferasyon sonrası beklenen alandan alana varyasyon hakkında fikir vermek amacıyla üç alan için değerler belirtilmiştir. Mikro kolonilerin mekanik direnci, kayma gerilmesi seviyesi santimetrekare başına 10 dine çıkarılarak test edilmiştir; ancak vahşi tip mikro koloniler dirençliyken, pill v mutantı tarafından oluşturulan mikro koloniler akış artışıyla parçalanmaktadır. Bu mutant, mikro kolonilerin altındaki plazma membranının yeniden şekillenmesini tetileyemez ve bu nedenle gelişimi sonrası artan kayma gerilmesine karşı daha duyarlıdır.Bu teknik, enfeksiyon hastalıkları alanındaki diğer araştırmacıların, kayma geriliminin çeşitli patojenlerin farklı hücre tipleriyle etkileşimi üzerindeki etkisini incelemelerine ön ayak olmuştur. İnsan patojenleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman ikinci veya üçüncü seviye önlemler gibi güvenlik önlemleri alınmalıdır.

introducing-shear-stress-in-the-study-of-bacterial-adhesion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Ditkowski, B. ve diğerleri. Greft dokularına bakteriyel yapışkanlığı incelemek için paralel plaka perfüzyon sisteminin in vitro modeli. J. Vis. Exp. (2019).Bu video, paralel plakalı akış odası kullanılarak floresan etiketli bakterileri damar greft dokuları üzerinde perfüze etme yöntemini göstererek, kesme akış koşullarında bakteriyel yapışma ve erken patogenezin kontrollü analizini mümkün kılmaktadır.

In vitro paralel plaka akış modeli, doku biyopsisinde bakteriyel yapışmayı incelemek için

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Bakterilerin kesme gerilimi altındaki kan damarları ile etkileşimini incelemek için, vasküler yapışmaya katkıda bulunan bakteri ve konak faktörlerini incelemeye izin veren bir akış odası ve in vivo mezenterik intravital mikroskopi modeli tanımlanmıştır.

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

Konak hücrelere bakteri bağlanması, konak kolonizasyonu ve enfeksiyonu sırasında önemli bir adımdır. Bu protokol, diğer bakteriyel faktörlerden bağımsız olarak, bireysel adezinlerin bu süreçlere katkısının analizine izin veren biyomimetik malzemeler olarak polimere bağlı rekombinant adezinlerin üretilmesini tanımlar.

Bakteri-konak Etkileşimleri karakterize etmek Biyomimetik Malzemeler

Bu akış yapışma deneyi T hücresi epitel hücre etkileşimleri basit, çok etkili bir model sağlar. Bir şırınga pompası kayma gerilimi oluşturmak için kullanılır ve konfokal mikroskopi ölçümü için görüntü yakalar. Bu çalışmaların amacı, etkili akış koşulları kullanılarak T hücre yapışmasını ölçümüdür.

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

mekanik gerilim iletmek ve doku homeostazında ve geliştirme dahil sinyal yollarını başlatmak gibi hücre yüzey yapışıklıklar, mechanotransduction merkezi bulunmaktadır. Burada, ligand kaplı manyetik mikroboncukları ve yapışma reseptörlerine kuvvet uygulaması ile, gerilim cevap olarak aktive edilir biyokimyasal yollar kesme için bir protokol mevcut.

Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi

Bakteriyel enfeksiyon yapisan hücre hücre dışı matriks sertlik etkisi problama için çok iyi biçim polyacrylamide tabanlı tahlil geliştirdik. Bu tahlil akış sitometresi, immunostaining ve çekiş kuvvet mikroskobu, hücreler, hücre dışı matriks ve patojen bakteriler arasında biyomekanik etkileşimlerin nicel ölçümler için izin ile uyumludur.

Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil

Burada, Pseudomonas aeruginosa biyofilmler araç da dahil olmak üzere yeşil flüoresan proteinler ifade üzerinde kesme stres etkileri analizi için floresan mikroskop ile birleştiğinde bir akışı sağlayarak daha yüksek mikrosıvısal biyoreaktör kullanımını açıklar biyofilm kapsamı, büyüme oranı ve morfolojik özellikleri belirlenmesi, ayarla.

Canlı hücre analizi, yamultma stres bir otomatik yüksek üretilen iş mikrosıvısal sistemi kullanarak Pseudomonas aeruginosa

Bu yöntem, hücresel yapışmanın erken dinamiklerini ölçmek ve ankraja bağlı hücrelerin fibronektin üzerine yayılması için yararlıdır. Ayrıca, bu tetkik hücre yayılımı ve / veya hücre adezyonu ile ilgili hücre içi sinyal yolları üzerinde değişmiş redoks homeostaz etkilerini araştırmak için kullanılabilir.

Oksidatif Stres Sırasında Fibronektin Üzerine Hücresel Adezyon Dinamiğinin İncelenmesi ve Epitel Hücrelerinin Yayılması

Bu protokol, hızlı hücre yuvarlaması yapışması sırasında yapışma olaylarını görüntüleyene kadar yapışma ayak izi testini gerçekleştirmek için deneysel prosedürleri sunar.

Yapışma Ayak İzi Tahlili ile Hücre Yuvarlanmasında Görüntüleme Moleküler Yapışması

Keşfedin, akış odaları kullanarak endotelyal hücrelere bakteriyel yapışmayı inceleyen bu yöntemi. Neisseria meningitidis gibi patojenlerin fizyolojik koşullardaki davranışlarını anlamak için değerli bir çerçeve sunar.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

Daha fazla video keşfet