Vivo Çift Yüzey Bioluminescent Imaging'de

Bu prosedür, ren ve ateş böceği lusiferazını görselleştirir ve miktarını belirler. İn vivo ortotopik tümörler geliştirirken, önce ya ren vanilla ya da ateş böceği lusiferazını veya her ikisini eksprese eden stabil hücre hatları oluşturarak başlayın. Ardından, stabil olarak eksprese edilen reporter konstrüktün in vitro regülasyonunu fonksiyonel olarak doğrulayın.

Bir sonraki adım, hücrelerin meme yağ yastığına nakledilmesi ve hem ren hem de ateş böceği lusiferaz okumalarının elde edilip miktarının belirlenmesidir. Bu tekniğin immünohistokimya gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tümör ilerlemesi ve metastaz sırasında in vivo gen düzenlemesinin boylamsal ve dinamik bir görünümüne olanak tanımasıdır. İşleme, vanilla lusiferaz kodlayan bir ekspresyon vektörü ile kültüre edilmiş dört T one meme karsinomu hücresini transjekte ederek başlayın.

Transfekte edilenleri optimize edilmiş bir antibiyotik konsantrasyonu altında birkaç gün boyunca inkübe edin. Ardından, ekspresyon derecesini izlemek için ran vanilla luciferase eksprese eden yaklaşık 10 bireysel koloni seçin. Fonksiyonel analizler için yüksek miktarda ran vanilla luciferase eksprese eden kolonileri amplifiye etmeye devam edin.

İlgilenilen promotör bölgesini, stabil vanilla ekspresyonu seçimi için kullanılandan farklı bir seçilebilir markör içeren PGL four lusiferaz raporlayıcı plazmidine alt klonlayın, malign hücreleri transfekte edin ve 96 kuyucuklu plakalarda geleneksel in vitro hücre tabanlı lusiferaz raporlayıcı gen analizlerini kullanarak ateş böceği lusiferazından oluşan stabil poliklonal popülasyonu seçin; DBR hücrelerinin ateş böceği lusiferaz ekspresyonunu, geçici olarak transfekte edilen parental hücrelerde gözlemlenenle uyumlu bir şekilde regüle ettiğini doğrulayın. Bu vektörlerle, hücreleri lizlemek için 15 dakika boyunca orbital çalkalayıcıya yerleştirin.

Ayrıca, vanilla'nın CMV tarafından yönlendirilen ekspresyonunun çeşitli hücre stimülasyonları veya tedavi koşulları tarafından regüle edilmediğini doğrulayın. DBR metastatik four one memory karsinom hücrelerini, düşük ko-fluoresans ile planlanan günden bir gün önce çoğaltın. İn vivo inokülasyon pasajı için, inokülasyon yapılacak four one hücrelerini tripsin ile dissosiye edin.

Büyüme ortamında iyice yıkayın ve hücreleri hemen PBS ile seyreltin. Buz üzerinde saklayın. Dört ila altı haftalık dişi bowel C farelerini izofloran ile anestezi edin.

Bir pens kullanarak dördüncü inguinal hafıza pedini nazikçe kavrayın ve kaldırın. 27.5 gauge bir iğneyi, eğimli tarafı yukarı gelecek şekilde dikkatlice yerleştirin ve meme ucunun hemen altındaki hafıza yağ pedine enjekte edin.

İğnenin karın boşluğuna itilmemesine özellikle dikkat edin. Bezi serbest bırakın ve fareler henüz anestezi altındayken hücre süspansiyonunun 50 µL'sini bellek yağ pedine yavaşça enjekte edin. Lateral kuyruk venine 100 µL kırmızı eject cine enjekte edin.

Fareyi derhal IVUS 200 görüntüleme sistemine yerleştirin ve bir dakikalık lüminesans görüntü alımı gerçekleştirin. Fareyi yaklaşık bir saat boyunca tekrar kafesine geri alın; bu işlem, kalıntı ran vanilla Lucifer sinyalinin tamamen dağılmasını sağlar. Şimdi, beş dakika sonra IP enjeksiyonu yoluyla D Lucifer potasyum tuzu uygulayın ve fareyi isof fluorine kullanarak anesteziye alın.

Karşılaştırılabilir bir konumdaki IVUS 200'e aktarım, orijinal RAN vanilla görüntülemede gerçekleştirilir. Fotonlar moduna ayarlanmış IVUS living image yazılımı kullanılır. Hem standart hem de firefly görüntülemeleri için değerler belirlenir.

Oldukça agresif olan 41 hücreleri bir hafta içinde elle hissedilebilir tümörler oluşturur. Bu nedenle, genel tümör büyümesini ve metastazı izlemek için farelere her hafta red eject cine enjekte edin. Ardından, tümör gelişiminin çeşitli aşamalarında yola özgü sinyalleri izlemek için d Lucifer enjekte edin.

RAN lusiferaz kazanımlarını, tümör hücresi inokülasyonundaki ilk ölçümlere göre normalize ederek primer tümör büyümesini takip edin. Daha da önemlisi, tümör büyümesi ve progresyonuna bağlı olarak bireysel sinyal sistemlerinin zamansal düzenlemesini belirlemek için zaman içindeki RLR değerlerini hesaplayın. Şimdi, tümör büyümesi ve metastazına bağlı olarak bireysel sinyal sistemlerinin mekansal düzenlemesini belirlemek için pulmoner RLR değerlerini, primer tümör için hesaplananlarla karşılaştırın.

Primer tümör içindeki hücresel kompozisyondaki değişimleri görselleştirmek ve takip etmek için çift biyolüminesans görüntüler kullanılır. İlk olarak, vanilla luciferase eksprese eden 4T1 hücrelerini, non-metastatik ve izojenik olan firefly luciferase eksprese eden 4T07 karşılıklarıyla karıştırın; ardından daha önce gösterildiği gibi, bu karıştırılmış meme kanseri hücresi popülasyonlarının farklı oranlarını meme yağ pedine enjekte edin. Belirli bir inoküle edilmiş hücre karışımını temsil eden başlangıç RS değerlerini belirlemek için hem firefly hem de vanilla luciferase görüntülerini hemen edinin.

Primer tümör içindeki hücresel kompozisyonu betimlemek için boylamsal çift biyolüminesans görüntüler almaya devam edin. Ayrıca, her bir meme kanseri türevinin uzay-zamansal metastazını, tümör büyümesi ve progresyonu ile ilişkili olarak değerlendirin. Her bir görüntü dahili olarak tutarlı ve kontrollü olduğundan, primer tümörden gelen kalıcı sinyal, her bir vanilla ve firefly veri ediniminin genel ardıl başarısızlığını ölçmek için önemli bir metriktir.

Linine substratı, otolüminesanla sonuçlanan oksidasyona karşı oldukça hassastır. Burada, başarısız bir lanine IV enjeksiyonu, yerleşmiş primer tümörden değil, bağırsak kanalından spesifik olmayan sinyal üretmektedir. 41 primer tümör ve pulmoner metastaz taşıyan bir farede gerçekleştirilen bu başarılı renal görüntülemede, ateş böceği lusiferaz görüntülemesi yoluyla yola özgü sinyal ölçümleri elde edilebilir.

Bu veriler, hem primer tümörden hem de akciğer metastazlarından RS'nin hesaplanmasına olanak tanır. Bu deneyin tamamlanmasının ardından, mRNA ve protein düzeyindeki sonuçların bildirdiğiniz konstrükt ile benzer şekilde düzenlendiğini doğrulamak için immünohistokimya ve in situ hibridizasyon gibi diğer teknikler kullanılabilir.