Vivo Çift Yüzey Bioluminescent Imaging'de

Bu yazıda onların büyüme ve metastaz sırasında metastatik meme kanseri hücrelerinde ifade böceği ve Renilla lusiferaz enzimler hem bioluminescent reaksiyonları, inşa görselleştirmek ve ölçmek için yöntemler tarif

Bu prosedür, ran ve ateşböceği lusiferazı görselleştirir ve ölçer. Gelişmekte olan in vivo ortotopik tümörler, vanilya veya ateşböceği lusiferaz veya her ikisini birden eksprese eden stabil hücre hatları oluşturarak başlar. Ardından, kararlı bir şekilde ifade edilen raportör yapısının in vitro düzenlemesini işlevsel olarak doğrulayın.

Bir sonraki adım, hücreleri meme yağ yastığına aşılamak ve hem koşan hem de ateşböceği lusiferaz okumalarını elde etmek ve ölçmektir. Bu tekniğin immünohistokimya gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, tümör ilerlemesi ve metastazı sırasında in vivo gen regülasyonunun uzunlamasına ve dinamik bir görünümüne izin vermesidir. Vanilya lusiferaz kültürünü kodlayan bir ekspresyon vektörü ile dört T bir bellek karsinom hücresini keserek başlayın.

Birkaç gün boyunca optimize edilmiş bir antibiyotik konsantrasyonu altında transfect. Ardından, ekspresyon derecesini izlemek için yaklaşık 10 ayrı çalışan vanilya lusiferaz eksprese eden koloni seçin. Fonksiyonel analizler için yüksek miktarda vanilya lusiferaz ifade eden kolonileri büyütmeye devam edin.

İlgilenilen promotör bölgesini, stabil vanilya ekspresyonunu seçmek için kullanılandan farklı seçilebilir bir işaretleyici barındıran bir PGL dört lusiferaz raportör plazmidine alt klonlayın, malign hücreleri transfekte edin ve geleneksel in vitro hücre bazlı lusiferaz raportör gen tahlillerini kullanarak ateşböceği lusiferazın stabil poliklonal popülasyonunu seçin 96'da. Kuyu plakaları, DBR hücrelerinin, geçici olarak transfekte edilen ebeveyn hücrelerinde gözlemlenenle uyumlu bir şekilde ateşböceği lusiferaz ekspresyonunu düzenlediğini doğrular. Bu vektörlerle, hücreleri bitlemek için hücreleri 15 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin.

Ayrıca, vanilyanın CMV güdümlü ekspresyonunun çeşitli hücre stimülasyonları veya tedavi koşulları tarafından düzenlenmediğini doğrulayın. DBR metastatik dört adet tek bellekli karsinom hücresini planlanandan bir gün önce düşük co akıcılığına sahip çoğaltın. İn vivo aşılama geçişi, aşılama için hücreler dört tek hücreyi tripsin ile ayırır.

Büyüme ortamında iyice yıkayın ve hücreleri hemen PBS'de seyreltin. Buz üzerinde saklayın. Dört ila altı haftalık dişi bağırsak C fareleri isof flor ile uyuşturuldu.

Forseps kullanarak. Dördüncü kasık hafıza pedini nazikçe kavrayın ve kaldırın. 27.5 gauge iğne eğimli tarafı yukarı bakacak şekilde dikkatlice yerleştirin ve doğrudan meme ucunun altındaki hafızalı yağ yastığına enjekte edin.

İğneyi karın boşluğuna itmemeye özellikle dikkat edin. Bezi serbest bırakın ve fareler hala anestezi altındayken 50 mikrolitre hücre süspansiyonunu yavaşça hafıza yağ pedine enjekte edin. Yanal kuyruk damarına 100 mikrolitre kırmızı çıkarma silindiri enjekte edin.

Fareyi hemen IVUS 200 görüntüleme sistemine yerleştirin ve bir dakikalık parlak bir görüntü elde edin. Fareyi yaklaşık bir saat boyunca kafesine geri aktarın, bu da kalan vanilya Lucifer sinyalinin dağılmasını sağlar. Şimdi D Lucifer potasyum tuzunu beş dakika sonra IP enjeksiyonu yoluyla uygulayın, fareyi flor kullanarak uyuşturun.

Karşılaştırılabilir bir konumda IVUS 200'e aktarım, orijinal RAN vanilya görüntü alımında gerçekleşir. Foton moduna ayarlanmış IVUS canlı görüntü yazılımını kullanma. Hem Firefly satın almaları hem de firefly satın almaları için değerler belirleyin.

Oldukça agresif olan 41 hücre, bir hafta içinde ele gelen tümörler oluşturur. Bu nedenle, genel tümör büyümesini ve metastazı izlemek için her hafta farelere kırmızı çıkarma siini enjekte edin. Daha sonra, tümör gelişiminin çeşitli aşamalarında yola özgü sinyalleri izlemek için d Lucifer'i enjekte edin.

Tümör hücresi inokülasyonundaki ilk ölçümlere RAN lusiferaz edinimlerini normalleştirerek birincil tümör büyümesini takip edin. Daha da önemlisi, tümör büyümesi ve ilerlemesine göre bireysel sinyalizasyon sistemlerinin zamansal düzenlemesini oluşturmak için zaman içindeki RLR değerlerini hesaplayın. Şimdi, tümör büyümesi ve metastazı ile ilgili bireysel sinyal sistemlerinin mekansal düzenlemesini belirlemek için pulmoner RLR değerlerini birincil tümör için hesaplananlarla karşılaştırın.

Çift biyolüminesan görüntüler, primer tümör içindeki hücresel bileşimdeki değişiklikleri görselleştirmek ve izlemek için kullanılır. İlk olarak, dört T bir hücreyi metastatik olmayan ve izojenik ateşböceği lusiferaz ile dört T oh yedi muadilini eksprese eden karışık vanilya lusiferaz, daha sonra bu karışık meme kanseri hücre popülasyonlarının değişen oranlarını daha önce gösterildiği gibi meme yağ yastığına enjekte eder. Belirli bir aşılanmış hücre karışımının ilk RS temsilcisini oluşturmak için hemen hem ateşböceği hem de vanilya lusiferaz görüntülerini elde edin.

Primer tümör içindeki hücresel bileşimi göstermek için uzunlamasına çift biyolüminesan görüntüler elde etmeye devam edin. Ayrıca, tümör büyümesi ve ilerlemesine göre her bir meme kanseri türevinin uzay-zamansal metastazını değerlendirin. Her görüntü dahili olarak tutarlı ve kontrollü olduğundan, birincil tümörden gelen kalıcı sinyal, her bir vanilya ve ateşböceği veri toplamasının genel ardıl başarısızlığını ölçmek için önemli bir ölçümdür.

Linin substratı, oksidasyona karşı oldukça hassastır ve bu da otomatik lüminesans ile sonuçlanır. Burada, başarısız bir IV lanin enjeksiyonu, yerleşik primer tümörden değil, bağırsak sisteminden spesifik olmayan sinyal üretir. 41 primer tümör ve pulmoner metastaz yolağının bir fare yatağının bu başarılı böbrek ediniminde, ateşböceği lusiferaz görüntülemesinden spesifik sinyal ölçümleri elde edilebilir.

Bu veriler, hem primer tümörden hem de pulmoner metastazlarından RS'nin hesaplanmasına izin verir. Bu deneyin tamamlanmasının ardından, mRNA ve proteindeki sonucun bildirilen yapınıza benzer şekilde düzenlendiğini doğrulamak için immünohistokimya ve in situ hibridizasyon gibi diğer teknikler kullanılabilir.