Name: Wild-tip ve Süs Çeşitler arasında ayırt A PCR tabanlı Genotiplendirme Yöntemi Imperata cylindrica /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Öğrenin Imperata cylindrica çeşitlerini ayırt etmek için hızlı ve uygun maliyetli bir PCR tabanlı genotipleme protokolü. Bu yöntem, morfolojik olarak benzer yabani tip ve süs çeşitlerini doğru şekilde tanımlayarak istilacı türlerin yayılmasını önler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz örnek edinme konusunda yardım için Alan Tasker (USDA-APHIS, Riverdale, MD), Stephen Compton (Clemson), Sherry Aultman (Clemson), Craig Ramsey (USDA-APHIS, Fort Collins, CO), ve Betty Marose (UMD) teşekkür . Biz video filme yaptığı çalışmaların öğrencileri Andrew Adrian (UA-Huntsville) ve Derek Thacker (UA-Huntsville) bu protokol test kendi yardım için, ve Joseph Herdy teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Balık ve Yaban Hayatı Vakfı tarafından finanse edildi.

1. Örnek Toplanması ve Korunması Bu yöntem geliştirilmiş ve taze, dondurulmuş, kurutulmuş yaprak ve son zamanlarda doku kullanılarak test edildi. <ol><li> Cogongrass ve / veya ot türlerinin belirlenmesi konusunda uzmanlaşmış bir taksonomisti yardımı ile dokulara JBG tanımlayın. Onun parlak kırmızı yapraklı, süs JBG görsel dönmek wild-tip cogongrass ve JBG ayırt etmek kolaydır, ancak cogongrass ve JBG dönmek birbirinden neredeyse ayırt edilemez niteliktedir. Cogongrass ve JBG rücu fenotipi yeşil, uzun yapraklı, oldukça büyük ve uzun rizomlar ve JBG 12 (Şekil 1) daha fazla yaprak alanı var. </li><li> Taze yaprak dokusu en bol ve en yüksek kalitede DNA sağlar ve tarla veya sera yetiştirilen I. tahsil edilebilir cylindrica bitkiler. Taze doku kullanılacak ise, bozulması önlemek için toplama 3 saat içinde DNA ayıklayın. Aksi takdirde, depolama, keepi için doku hazırlanmasıdoğrudan güneş ışığı ng doku serin ve dışarı. </li><li> Daha sonraki bir tarihte DNA ekstraksiyonu için dokuların saklamak için en uygun yöntem hemen -80 ° C de doku dondurmak ve depolanmasıdır. Dondurulmuş doku DNA ekstraksiyon önce çözülmeyi izin vermeyin. Çözülme önlemek için DNA ekstraksiyon taşlama adımları önce sıvı azot için dondurulmuş doku aktarın. </li><li> Bir -80 ° C derin dondurucuda kullanılabilir değilse, kuru doku hemen. Kuru depolanması için, bir kağıt zarf halinde doku yerleştirmek ve kurutulmuş silika jel veya oda sıcaklığında diğer aktif kurutucular içinde zarfı depolamak. Karıştırılır göstergesi silika küçük bir miktarı olmayan gösteren bir silika silika için tamamen kurutulmuş ve uygundur sağlayacak olan bitki doku kurutma. </li><li> En az 10 kat ağırlık taze yaprak daha silika jel kullanın. Bitki dokusunda 24 saat içinde kuru olmalıdır. DNA nitelik ve nicelik (herbaryum numunenin durumunda olduğu gibi, zaman içinde kuru depolanması aracılığıyla azalırs). </li></ol> 2. DNA Ekstraksiyonu Bir küçük değişiklik ile üreticinin talimatlarına; bitki dokularından DNA ayıklamak için, DNeasy Bitki Mini Kit (Cat # 69.104 veya 69.106 Qiagen, Valencia, CA) izleyin. Bunun yerine her sütun için önerilen en az 100 mg taze doku veya daha az 20 mg kuru doku kullanarak, uygun tüplere (kuru doku veya&gt; 20 mg), taze veya dondurulmuş doku 100 mg aktarmak den az 100 mg eziyet ve ekstraksiyonu için. Nükleer ve plastid DNA aynı anda elde edilir. <ol><li> Bu işlemler başlamadan önce, etanol doğrulamak tamponlar AP3 / E ve AW ilave edildi. </li><li> Soğutulmuş bir havanda in taşlama ile sıvı azot üç tur kullanılarak ince bir toz olarak taze dondurulmuş doku yaprağı (ya da kuru yaprak doku&gt; 20 mg)&gt; 100 mg öğütün. Başlangıç ​​materyali yetersiz bozulması ya da yetersiz lizis olabilir, aynı zamanda DNA düşük verimler yol açar. Dikkatle Tiss öğütmekue ve çok fazla doku ile sütunlar aşırı değildir. </li><li> Tampon AP1 400 ul ve her bir tüp, bir küçük bir raf yerleştirilebilir RNaz A. 4 ul içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne taze dondurulmuş doku (ya da kuru toz dokudan 20 mg) ila 100 mg donmuş toz transferi tüp başına doku ağırlığı doğru izlemek için dengelemek. </li><li> Vorteks veya titreme örneği (ler) karıştırılır ve 65 'de 10 dakika inkübe ° C arasında, 2-3 kere inkübasyon sırasında ters tüp (s). </li><li> Her numune için Tampon AP2 130 ul ekleyin. Ters tüp (s), birkaç kez ve buz üzerinde 5 dakika süreyle inkübe ile karıştırılır. </li><li> Pipetleyin her biri ayrı bir QIAshredder Mini spin kolon içine lizat ve 2 ml toplama tüpüne (kiti ile sağlanır) her sütuna yerleştirin. 2 20.000 xg (~ 14.000 rpm) dk ve her yeni bir tüp (kit ile birlikte) içine fraksiyon akış yoluyla herhangi oluşan pelet bozmadan aktarmak için Santrifüj kolon (lar). </li><li> / Tampon AP3 1.5 hacimleri ekleE, ve pipetleme ile karıştırın. </li><li> 2 ml'lik toplama tüpüne bir DNeasy Mini spin kolon karışımın içine 650 ul aktarın. 1 6.000 xg (~ 8,000 rpm) dk ve akış yoluyla atmak için Santrifüj kolon (lar). Her numune için kalan karışımı ile bu adımı yineleyin. </li><li> Yeni bir 2 ml toplama tüp (ler) içine spin kolon (lar) yerleştirin ve her sütunun üst Tampon AW 500 ul ekleyin. 1 6.000 xg (~ 8,000 rpm) dk ve akış yoluyla atmak için Santrifüj kolon (lar). </li><li> Her sütunun üst Tampon AW başka 500 ul ekleyin. 20,000 xg (~ 14.000 rpm) 2 dakika süreyle santrifüjleyin. Bu aşama, böylece PCR inhibe edebilir tamponlar içinde bulunan herhangi bir kalıntı etanol kaldırarak, kolon kuruyacak. </li><li> Yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj örnek tüp için her spin kolon aktarın. Elüsyon için her sütun başına 100 mikrolitre Tampon AE ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kolonu (ler) inkübe edilir. DNA toplamak için 6000 x g'de (~ 8.000 rpm) 1 dakika boyunca santrifüj; kolon (s). </li><li> Bu elüsyon 200 ul numune elde etmek için aynı 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine DNA elüt edilerek, bir kez adımları tekrar. Kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklayın DNA örnekleri. DNA konsantrasyonları doku tipi ve depolama koşullarına bağlıdır. Tampon AE 200 ul toplam ile elüt DNA zaman optimum verimleri elde edilmiştir, ancak konsantrasyonları elüsyon hacmi kadar az 50 ul kadar indirgenmiş halinde arttırılabilir. </li></ol> 3. DNA Kalite ve Miktar doğrulanması <ol><li> Bir spektrofotometre veya florimetre ve jel elektroforezi kullanılarak PCR kurulum öncesinde çıkarılan DNA kalitesi ve miktarı test edin. Bu, sonraki adımların başarı sağlamaya yardımcı olur. </li><li> Bir spektrofotometre, DNA testi kalite ve miktar kullanma. İyi DNA verimleri 50 ile 150 arasında olmalıdır 2.0 yakın 260/280 ve 230/280 oranlarında ul / ng. Bir örnek olarak, Şekil 2 NanoDrop spektrofotometre (ThermoScientific kullanılarak iyi kalitede sonuçlarını göstermektedir , Wilmington, DE). </li><li> Standart% 1 agaroz jel kullanılarak elektroforez yürütün. RNA kontaminasyonu çok az şeritli (Şekil 3) hiçbir nispeten geniş bant (&gt; 10 Kb) varlığını doğrulayın. </li><li> DNA konsantrasyonu yüksek, seyreltik DNA örnekleri sonraki adım için 70 ng / ul için ise. </li></ol> 4. PCR primerleri Bu protokolde kullanılan PCR primerleri cogongrass ve JBG genotiplerinin plastid trnL-F ayırıcı bölgesi arasındaki farklılıklar sekansı esas alır. Bu farklılıklar SNP'lerin formu (tek nükleotid polimorfizmleri) ve benzersiz dizilerinin siteleri (Şekil 4) primerler bularak çeşitli spesifik primerler gelişimine izin indellerin (Eklemeler ve Silmeler) gelir. <ol><li> Primerlerin kalitesi PCR sonuçları üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Saygın bir şirketten Sipariş astarlar. Biz Eğik Bio, Inc (bizim astar siparişWww.obliquebio.com/web/ :/ / "target =" _blank "sadece standart tuzsuzlaştırma prosedürleri talep&gt; http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL). </li><li> trnL-F pozitif kontrol primerleri: Bu primer seti 11-13 en çim takson plastid trnL-F boşluk bölgesi güçlendirir ve iyi bir pozitif kontrol (bir 890 bp bant ile sonuçlanan) olarak hizmet vermektedir. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Dizi </td></tr><tr><td> trnF (GAA)-F </td><td> 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 ' </td></tr><tr><td> trnL (5 'ekzon)-C </td><td> 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 ' </td></tr></tbody></table></li><li> Yabani tip cogongrass primerler: Bu primer seti cogongrass özeldir ve genotiplerinin JBG arasında trnL-F bölgesi amplifiye değildir. 595 bp bir bantta set sonuçları. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Sequence </td></tr><tr><td> trnLF-C-F1 </td><td> 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 ' </td></tr><tr><td> trnLF-C-R1 </td><td> 5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 ' </td></tr></tbody></table></li><li> JBG ve JBG primerler dönme: Bu primer seti genotipine JBG özeldir ve cogongrass arasında trnL-F bölgesi amplifiye değildir. 594 bp bir bantta set sonuçları. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Dizi </td></tr><tr><td> trnLF-R-F2 </td><td> 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 ' </td></tr><tr><td> trnLF-R-R2, </td><td> 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 ' </td></tr></tbody></table></li><li> -20 ° C, uzun süreli saklanabilir 100 mM stok çözümler elde etmek için nükleaz içermeyen GKD 2 O yeterli hacmi her astar yeniden süspanse edin. </li><li> PCR kurulum adımları önce 12 mM her astar stok sulandırınız. </li></ol> 5.. PCR Kurulum DNA ekstraksiyon PCR reaksiyonlarında primer seti Yukarıdaki her biri kullanılarak amplifiye edilir. Tüm PCR iyi çalışıyoruz ve bir grup oluşturabilir sağlamak için bir pozitif kontrol ekleyin. Reaktiflerin hiçbirinin istenmeyen DNA ile kontamine sağlamak için bir negatif kontrol ekleyin. Negatif kontrol yapılması şablonu içeren ve hiçbir bant üretimi neden. <ol><li> Termalcycler blok ve örnek arasında daha iyi ısı transferi sağlamak için ince duvarlı PCR tüpleri tüm reaksiyonlar hazırlayın. Biz kontaminasyonu önlemek için piyasada bulunan aerosol-free pipet uçları kullanmanızı öneririz. </li><li> Her izole DNA örneği için, aşağıda listelenen sırada ICE aşağıdaki reaktifler ekleyerek 0.2-ml ince duvarlı PCR tüpleri yukarıdaki primer setleri her kullanılarak 50 ul PCR reaksiyonları kurdu. Birden fazla numune hazırlanmaktadır, özel durum tüm reaktifleri içeren bir kokteyl yapmakDNA örneğinin bütün reaksiyonlar arasında düzgün koşulları kurmak. <table border="1"><tbody><tr><td> PCR Reaktif </td><td> İkinci Cilt </td><td> Final zenginleştirmesi </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen GKD 2 O </td><td> 40.5 ul </td><td></td></tr><tr><td> Avantaj 2 10X PCR Buffer (Clonetech, CA) </td><td> 5.0 ul </td><td> 10% (v / v) </td></tr><tr><td> Avantajı ultrapure PCR dNTP Mix (10 mM her biri Clonetech, CA) </td><td> 1.0 ul </td><td> 0.2 mM </td></tr><tr><td> Primer 1 (GKD 2 O 12μM) </td><td> 1.0 ul </td><td> 0.24 uM </td></tr><tr><td> Primer 2 (GKD 2 O 12μM) </td><td> 1.0 ul </td><td> 0.24 uM </td></tr><tr><td> Avantaj 2 Polimeraz Mix (Clonetech, CA) </td><td> 0.5 ul </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> DNA ekstraksiyonu(70 ng / reaksiyon; gerektiği gibi GKD 2 O ses seviyesini ayarlamak) </td><td> 1.0 ul </td><td> 1.4 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> Toplam: 50.0 ul </td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Tüm PCR iyi çalıştığından emin olmak için, pozitif kontrol primerler kullanılarak pozitif kontrol kurmak. Bu primer seti dönmek ve diğer otlar JBG, cogongrass, JBG için eşit derecede iyi çalışıyor ve 890 bp olan bir bant ile sonuçlanacaktır. </li><li> Bunun yerine DNA ekstraksiyon GKD 2 O kullanılarak, pozitif kontrol olarak ayarlanır aynı kontrol primer kullanılarak negatif kontrol ayarlamak. Tüm reaktifler DNA kirletiyorsa serbest ise, bu reaksiyon bir grubu ile sonuçlanacaktır. </li><li> DNA konsantrasyonu düşük olması durumunda, fazla DNA nükleaz içermeyen GKD 2 O miktarı 50 ul kadar toplam reaksiyon hacmi getirmek için kullanılan ayarlayarak, her bir reaksiyonun eklenebilir. DNA fazla 5 ul (% 10 kullanılmamalıdır r başına toplam hacmi)eaction, DNA örnekleri içindeki mümkün safsızlıklar PCR reaksiyonları inhibe edebilir. </li></ol> 6. PCR Bisiklete binme <ol><li> Aşağıdaki PCR bisiklet parametreleri kullanarak ısıtılmış bir kapak ile donatılmış bir termalcycler PCR amplifikasyon yürütmek. Biz standart sıcaklık tırmanışı koşulları ile çalışacak şekilde ayarlanır Mastercycle yanlısı S termalcycler (Eppendorf, Hauppauge, NY) kullanın. Herhangi bir kalite termalcycler iyi yapmalıdır. <table border="1"><tbody><tr><td> Devir </td><td> Tavlama denatürasyon </td><td> Polimerizasyon </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 95 de 2 dakika ° C </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 ° C de 30 saniye </td><td> 30 sn 61 ° C de 90 saniye 68 ° C'de 35 döngü </td></tr><tr><td> 3 </td><td></td><td> 68 de 5 dakika ° C </td></tr><tr><td colspan="3"> Örnek kaldırılır ° C'ye kadar, 4 at tut </td></tr></tbody></table></li><li> DNA kalitesine bağlı olarak gerektiği gibi PCR (primer tavlama sıcaklığı, uzatma süreleri ve devir sayısı dahil) için koşulları optimize, astar, PCR ile Taq polimeraz veya türü kullanılır. Biz optimum belirlerken bir degrade yetenekli thermocycler kullanmanızı öneririz sıcaklıklarda tavlama. </li><li> Kullanılan termalcycler ısıtılmış bir kapağı yoksa, PCR devir esnasında buharlaşmasını önlemek için her numunenin üst mineral yağı 1 damla ekleyin. </li></ol> 7. PCR Ürünlerinin Jel Elektroforez Analizin sonuçları görselleştirme, standart elektroforez ile% 1 agaroz jel üzerinde ayrı PCR ürünleri. <ol><li> Her amplifiye PCR ürün 5 ul ile standart bir DNA yükleme tamponu 2 ul (tipik olarak bir ya da 5x 6x çözeltisi) birleştirir. </li><li> E yapılan EtBr (DNA boyama etidyum bromid) ihtiva eden bir% 1 agaroz jel üzerine örnekleri Yükither TAE veya SB (sodyum borat) tampon sistemleri 16. Biz, 100 ml% 1 agaroz (0.1 ug / ml) başına 10 mg / ml EtBr stok solüsyonu 1 ul kullanabilir. </li><li> Boya ön ulaşıncaya kadar ~ 120V azından örnekleri çalıştırmak ¾ jel toplam uzunluğunun. </li><li> UV ışık altında (kısa dalga UV ışık kutusu gibi), uygun bir parçası amplifiye edildi görmek için çıkan bantları kontrol edin. </li><li> Kullanılabilir bir foto-dokümantasyon sistemi veya kamera kullanarak jel ve çıkan bantları belgeleyin. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar PCR ürünleri görselleştirme üzerine, cogongrass JBG ya JBG (Şekil 5) döndürülmesi ile karşılaştırıldığında özel bir bantlama desene sahiptir. Her bir DNA örneği için, trnL-F pozitif kontrol primer seti ~ 890 bp tek bir yüksek yoğunluklu bant neden. Bu, tüm PCR iyi çalıştığını doğrular. Benzer şekilde, negatif kontrol (hiçbir şablon) reaksiyonu herhangi bir astar s için bir bant içermelidiret kullanılır. Bu durum, reaktifler hiçbiri kontamine oldu doğrular. DNA vahşi tip cogongrass, JBG spesifik primerlerin herhangi bir bant neden olurken cogongrass spesifik primer seti ~ 595 bp tek bir grup ile sonuçlanacaktır kullanılarak bir PCR reaksiyonunda elde edilirse. DNA JBG türetilen ya JBG döndürülmesi durumunda cogongrass spesifik primerlerin herhangi bir bant neden olurken Keza, JBG spesifik primer seti kullanılarak bir PCR reaksiyonunda azından ~ 594 bp'lik bir tek grubu ile sonuçlanacaktır. JBG ve JBG geri intikal özdeş nükleik asit dizisi olduğu için, dolayısıyla aynı bant desenleri olacaktır. Birçok örnekte, aynı zamanda bir jel üzerinde karşılaştırılacak olursak, biz böylece daha kolay olumlu sonuçlar için numunelerin tarama yaparak, birbirlerine yanında kurulan her astar türetilen tüm örnekler çalıştırmanızı öneririz. Döner JBG ve JBG arasındaki morfolojik farklılıklar oldukça açıktır (yaprak ve JB küçük boy örneğin kırmızı renk PCR sonuçları aynı olacak ise G vs yeşil rengi, büyük boy ve JBG agresif büyüme dönmek), böylece, JBG çeşitleri bitkisel özellikleri kullanarak ayırt etmek kolaydır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Imperata cylindrica var. Koenigii (Japonca kan otu) yetiştirilen sera Karşılaştırılması, I. küçültülmüş cylindrica var. koenigii (JBG Döndür) ve I. cylindrica (Wild tip cogongrass). <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Bir NanoDrop spektrofotometre kullanılarak teyit DNA örnekleri bir örnek. Bakılmaksızın kullanılan spektrofotometrenin, 260/280 oranı 1.8 'e yakın olmalı ve 260/230 oranı 2.0 yakın gerektiğini unutmayın. ontent "&gt; <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. DNA örnekleri% 1 agaroz jel üzerinde standart jel elektroforezi kullanılarak doğrulandı. Bir ticari DNA işaret boyutu analizi için kullanıldı. Lane # 4 bulaşmasını ve bazı RNA kirlenme gösteren, düşük kaliteli DNA bir örnektir. <a href="/files/ftp_upload/3265/3265fig4_lg.jpg"><img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"></a> Imperata cylindrica var. Koenigii (Japonca kan otu) ile trnL-F bölgelerin Şekil 4. Sıra diziler I. küçültülmüş cylindrica var. koenigii (JBG Döndür) ve I. cylindrica (Wild tip cogongrass). Dikey siyah oklar SNP ve indellerin kaynaklanan dizileri farklılıklar göstermektedir. Yatay yeşil oklar cogongrass özgü PCR için kullanılmıştır yabanıl tür cogongrass primerlerin pozisyonları göstermektedir. Yatay kırmızı oklar po göstermektedirJBG ve JBG ve sonrası olarak bölünmüştür JBG özgü PCR için kullanılan primerler döner. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5. Cogongrass-ve JBG spesifik primerlerin ile yanı sıra trnL-F pozitif kontrol ve bir şablon negatif kontrol herhangi bir araya DNA örnekleri JBG ve geri JBG cogongrass türetilen PCR ürünlerinin jel elektroforezi, temsili sonucu.

<ol><li>Holm, L. G., Pancho, J. V., Herberger, J. P., Plucknett, D. L. A Geographical Atlas of World Weeds. , Krieger Publishing Company. Malabar, Florida, U.S. (1979).</li>
<li>CABI, Crop Protection Compendium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCABI%2C++%22Commonwealth+Agricultural+Bureau+International+%28CABI%29%22">Commonwealth Agricultural Bureau International (CABI)</a>. , Wallingford, UK. (2007).</li>
<li>MacDonald, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+-+Biology%2C+ecology%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cogongrass (Imperata cylindrica) - Biology, ecology, and management.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 23, 367-380 (2004).</li>
<li>Talley, S. M., Cseke, L. J. Molecular diagnostic technologies for invasive plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTalley%2C+SM+%22CPHST+Fort+Collins+Laboratory+2009+Annual+Report%22">CPHST Fort Collins Laboratory 2009 Annual Report</a>. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 27-28 (2009).</li>
<li>Dozier, H., Gaffney, J. F., McDonald, S. -K., Johnson, E. R. R. L., Shilling, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cogongrass+in+the+United+States%3A+History%2C+ecology%2C+impacts%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Technology%22%5BJournal%5D)">Cogongrass in the United States: History, ecology, impacts, and management.</a> Weed Technology. 12, 737-743 (1998).</li>
<li>Chikoye, D., Ekeleme, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weed+flora+and+soil+seedbanks+in+fields+dominated+by+Imperata+cylindrica+in+the+moist+savannah+of+West+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Research%22%5BJournal%5D)">Weed flora and soil seedbanks in fields dominated by Imperata cylindrica in the moist savannah of West Africa.</a> Weed Research. 41, 475-490 (2001).</li>
<li>Weber, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeber%2C+E+%22Invasive+Plant+Species+of+the+World%3A+A+Reference+Guide+to+Environmental+Weeds%22">Invasive Plant Species of the World: A Reference Guide to Environmental Weeds</a>. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2003).</li>
<li>Patterson, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shading+effects+on+growth+and+partitioning+of+plant+biomass+in+Cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+from+shaded+and+exposed+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">Shading effects on growth and partitioning of plant biomass in Cogongrass (Imperata cylindrica) from shaded and exposed habitats.</a> Weed Science. 28, 735-740 (1980).</li>
<li>Cole, J. T., Cole, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ornamental+grass+growth+response+to+three+shade+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Horticulture%22%5BJournal%5D)">Ornamental grass growth response to three shade intensities.</a> Journal of Environmental Horticulture. 18, 18-22 (2000).</li>
<li>Bryson, C. T., Koger, C. H., Byrd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+and+exposure+period+to+heat+on+cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature and exposure period to heat on cogongrass (Imperata cylindrica) viability.</a> Weed Technology. 21, 141-144 (2007).</li>
<li>Capo-chichi, L. J. A., Faircloth, W. H., Williamson, A. G., Patterson, M. G., Miller, J. H., van Santen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+Dynamics+and+Genotypic+Diversity+of+Cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+at+the+Point+of+Introduction+in+the+Southeastern+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Invasive+Plant+Science+and+Management%22%5BJournal%5D)">Invasion Dynamics and Genotypic Diversity of Cogongrass (Imperata cylindrica) at the Point of Introduction in the Southeastern United States.</a> Invasive Plant Science and Management. 1 (2), 133-141 (2008).</li>
<li>Talley, S. M., Ramsey, C. L. Experimentally assessing the invasive potential of plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTalley%2C+SM+%22CPHST+Laboratory+2009+Annual+Report%22">CPHST Laboratory 2009 Annual Report</a>. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 29-30 (2009).</li>
<li>Hodkinson, T. R., Chase, M. W., Lledó, M. D., Salamin, N., Renvoize, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetics+of+Miscanthus%2C+Saccharum+and+related+genera+%28Saccharinae%2C+Andropogoneae%2C+Poaceae%29+based+on+DNA+sequences+from+ITS+nuclear+ribosomal+DNA+and+plastid+trnLintron+and+trnL-F+intergenic+spacers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Res%22%5BJournal%5D)">Phylogenetics of Miscanthus, Saccharum and related genera (Saccharinae, Andropogoneae, Poaceae) based on DNA sequences from ITS nuclear ribosomal DNA and plastid trnLintron and trnL-F intergenic spacers.</a> J. Plant Res. 115, 381-392 (2002).</li>
<li>Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., Janzen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+DNA+barcodes+to+identify+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Use of DNA barcodes to identify flowering plants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23), 8369-8374 (2005).</li>
<li>Roodt-Wilding, R., Spies, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+relationships+in+southern+African+chloridoid+grasses+%28Poaceae%29+based+on+nuclear+and+chloroplast+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Systematics+and+Biodiversity%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic relationships in southern African chloridoid grasses (Poaceae) based on nuclear and chloroplast sequence data.</a> Systematics and Biodiversity. 4, 401-415 (2006).</li>
<li>Brody, J. R., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+boric+acid%3A+a+Tris-free%2C+cooler+conductive+medium+for+DNA+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis.</a> BioTechniques. 36, 214-216 (2004).</li>
<li>Chou, C. -H., Tsai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+the+intergenic+spacer+of+ribosomal+DNA+of+Imperata+cylindrica+%28L.%29+Beauv.+var.+major+%28Cogongrass%29+populations+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Bulletin+of+Academia+Sinica+%28Taipei%29%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in the intergenic spacer of ribosomal DNA of Imperata cylindrica (L.) Beauv. var. major (Cogongrass) populations in Taiwan.</a> Botanical Bulletin of Academia Sinica (Taipei). 40, 319-332 (1999).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

<html> ABD fidanlık ve peyzaj sanayi egzotik ve yeni bitki türlerinin yetiştirilmesi ve satan gelişirler. Ticaretin giderek artan küreselleşme ile birleştiğinde Bu, bir istilacı bitki türleri, girmek kurmak ve ABD&#39;de federal invaziv olma potansiyeline de dahil olmak üzere, genellikle mevcut değildir bilgiye dayanır bu tür bitkilerin düzenleme yeteneği yayacağı şansını artırır , yerli ve vatandaşlığa taksonlar doğru taksonomisi ve genetik çeşitlilik. Invaziv bitkilerin bilgimiz genelde sınırlı olduğundan, gizli invaziv özellikleri ile ithal bitkiler isteyerek sadece onlar bizim tarım ve doğal kaynaklar işgal daha sonra öğrenmek için getirilmiştir. Bu protokol, I. ile ilişkili bu sorunlara yönelik amaçlar doğru wild-tip cogongrass ve süs JBG muadili rücu formu ayırt edebilirsiniz ilk basitleştirilmiş moleküler yöntem sağlayarak cylindrica çeşitleri. Bu protokolün geliştirilmesi için jove_content &quot;&gt;, wild-tip cogongrass 2008 yılının Haziran ayında Jay, FL yakınlarındaki Santa Rosa County Pond Creek Orman Biriminde vatandaşlığa nüfus toplanmıştır. JBG ticari bir kreş (Bluebird Kreş, Inc temin edildi .. Riverdale, MA University Park ve Haziran 2009 yılında;;) 2008 yılı Haziran ayında yanı sıra Columbia ev sahibi koleksiyonundan, MO JBG Haziran 2008&#39;de Clemson University, SC de Campbell Jeoloji Müzesi avlusunda elde edilen döner ve Columbia, 2009 yılında MO (Leland Cseke tarafından tanımlanan) bir ev sahibi ön avludan. Tüm bitkiler Huntsville, Alabama Üniversitesi (Huntsville, AL) bulunan bir serada tutuldu. Bu bitkilerden toplanan DNA Genetik sekans genellikle barkod tesisleri 2 için kullanılan 9 bağımsız DNA bölgeleri derinliği karşılaştırmalarda dahil. Tüm durumlarda, JBG ile dizilimler, böylece yardımcı JBG geri olanlar için bir% 100 idi eşleşmeJBG gerçekten yeşil, invaziv forma dönmek doğrulayın. Sadece nükleer ITS ve kloroplast trnL-F bölgelerde genetik cogongrass ve JBG ayırt etmek için kullanılabilir farklar var. TrnL-F bölgede 2 SNP ve 2 indellerin (eklemeler ve silmeler) sahipken ITS bölgesi, cogongrass ve JBG arasında 3 SNP (tek nükleotid polimorfizmleri) bir toplam vardır. Bu genetik farklılıkların doğal tip cogongrass ve JBG döner ayırt edebilirsiniz ki geliştirilecek çeşitli spesifik PCR primerleri izin verdi. En güvenilir sonuçları plastid trnL-F bölgede elde edilen primerler gelmiş. Dolayısıyla, bu protokol cogongrass, JBG ve kloroplast genomunun trnL-F bölge ve JBG (Şekil 4) döndürüldü arasındaki farklar dizisi dayanmaktadır. Söz konusu çeşitlerin daha spesifik primerler oluşturmak yardımcı olmak ve yakından ilgili türler, al yanlış pozitif önlemek içinI. l bilinen trnL-F sekansları cylindrica çeşitleri ile ilgili çimen türleri (29 türünden 43 bağımsız dizileri, örneğin, Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix lacryma-iş buldum, Miscanthus sinensis, Saccharum officinarum, Sorgum halepense) den trnL-F dizileri ile karşılaştırıldı. Biz çim, çeşitli özel primerlerin özgüllük 29 tür arasında çeşitli spesifik primer dizilerinden araştırılmasına karşın kapsamlı diğer birçok ot türleri DNA çoğaltılması için, yeteneği gidilmemiş. Sonuç olarak, DNA çıkarılması için kullanılan doku dikkatle I. olarak tespit edilmelidir cylindrica önce bu protokol başlangıç ​​için. Çim, sonra cogongrass veya JBG ya olarak tespit edilemiyorsa, biz dizileri cogongrass veya JBG için tam bir eşleşme olduğundan emin olmak için PCR ürünü sıralama öneririz. Şu anda, belirli bir otu numunenin bir kimlik doğrulama en doğru yöntem t her iki PCR gerçekleştirmek için olanRNL-F ve ITS bölgeler, dizisi PCR ürünlerinin doğrulanması ve kesin takson bilinen dizileri dizilerinin karşılaştırılması izledi. DNA kontrolü Bu protokol ayrıntılı primerler (trnL-F bölge için) ya da diğer primerler diğer yayın 13-15 bu kullanılabilir kullanılarak büyütüldü edilebilir. Sıralama çok daha fazla emek ve basitleştirilmiş usuller kullanılarak daha yoğun bir maliyettir. PCR için kullanılan primerler kalitesi prosedürün başarısı için kritiktir. Biz Eğik Bio, Inc (edinilebilir Bu prosedür için primerler yaptık <a href="http://www.obliquebio.com/web/" target="_blank">http://www.obliquebio.com/web/</a> , Huntsville, AL). Eğik Bio gelen primerler sipariş için avantajı bizim laboratuarda optimizasyonu için kullanılan primerler olarak özdeş numune üretimi serisi her astar hacimde çok sayıda depolamak olmasıdır. Sonuç olarak, astar, sadece aynı sıra var, ama t değilhey bu protokolde kullanılan aynı üretim yeri gelir. Aynı partiden primerler kullanılarak, PCR primerleri kalitesinde farklılıklar sonucu olabilir prosedürü gereksiz değişkenler önlemek yardımcı olabilir. Aynı şekilde, diğer Taq polimeraz PCR, kullanılan Taq polimeraz kalitesi için sorunsuz çalışır ise PCR sonuçlarının kalitesi üzerinde bir etkisi olacak. PCR daha iyi tutarlılık sağlamak için, Clontech&#39;in reaktifleri kullanarak protokolü optimize etmiş. Avantaj 2 Polimeraz (Clontech, Mountain View, CA, Kedi # 639.201 veya 639.202) sağlam, sıcak başlangıç ​​Taq polimeraz karışımı ve yüksek özgüllük ve daha doğru amplifikasyonlar sağlamak için yardımcı olan bir redaksiyon enzimdir. Bu protokol anneden Otların içinde miras kloroplast DNA dayanır Çünkü cogongrass ve JBG genotipleri arasında hibridizasyon olaylar bizim moleküler tanımlama prosedürü ile çekilmiş olabilir. Hypridization suspe olduğu durumlardacted, biz her iki ebeveyn devralınan nükleer bölgeler kullanmanızı öneririz. Bitki genotipleme dikkate almak en sık kullanılan non-plastid değişken bölgenin nükleer ribozomal ITS bölgesi 13-15,17 olduğunu. Şu anda, aynı PCR tüpünde nükleer ITS bölgenin bununla kloroplast trnL-F bölgenin amplifikasyonu multiplekslemesi doğru ilerleme kaydedilmektedir. Nükleer DNA bölgeleri ile plastid multiplekslemesi potansiyel olarak tek başına ya kullanma sınırlamaları aşmak olur, ancak bu yöntemlerin ayrı ayrı bir dava üzerinde fizibilite belirlemek için optimizasyon ve ek değerlendirme gerektirir. Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) ve bu tür moleküler işaretleri (floresan astar probları), gibi yeni teknolojilerin kullanımı da fail-safe ve doğru bitki genotipleme yöntemler olarak değerlendirilmektedir. Burada sunulan protokol JBG vahşi tip cogongrass bu gelen geri ayırmak için hızlı ve güvenilir bir yaklaşım sağlar. Biz kullanmak teşvikBu protokolün rs Bu protokolün kullanılmasından elde edilen sonuçları rapor etmek bize. Bu paylaşılan bilgi JBG döner dağıtımı hakkında bilgi vermek yardımcı olacaktır. Bu aynı zamanda USDA de düzenleyiciler oldukça invaziv cogongrass çeşitlerinin yayılmasını ve potansiyel hibridizasyon aşmak gerekiyor olabilir eylemler hakkında bilinçli kararlar almanıza yardımcı olacaktır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DNeasy Bitki Mini Kit </td><td> Qiagen, Valencia, CA </td><td> 69104 veya 69.106 </td><td> Iyi kalitede DNA verir herhangi bir saygın genomik bitki DNA kiti bu işlemler için sorunsuz çalışır. </td></tr><tr><td> trnF (GAA)-F </td><td> Eğik Bio, Inc </td><td> 3-0578 </td><td> İleri pozitif kontrol astar </td></tr><tr><td> trnL (5 &#39;ekzon)-C </td><td> Eğik Bio, Inc </td><td> 3-0579 </td><td> Pozitif kontrol astar Ters </td></tr><tr><td> trnLF-C-F1 </td><td> Eğik Bio, Inc </td><td> 3-0864 </td><td> İleri vahşi tip cogongrass astar </td></tr><tr><td> trnLF-C-R1 </td><td> Eğik Bio, Inc </td><td> 3-0865 </td><td> Gerivahşi tip cogongrass astar </td></tr><tr><td> trnLF-R-F2 </td><td> Eğik Bio, Inc </td><td> 3-0866 </td><td> İleri JBG ve astar dönmek JBG </td></tr><tr><td> trnLF-R-R2, </td><td> Eğik Bio, Inc </td><td> 3-0867 </td><td> JBG ve astar dönmek JBG Ters </td></tr><tr><td> Avantajı ultrapure PCR dNTP Mix </td><td> Clontech&#39;in, Mountain View, CA </td><td> 639125 </td><td></td></tr><tr><td> Avantaj 2 Polimeraz </td><td> Clontech&#39;in, Mountain View, CA </td><td> 639.201 veya 639.202 </td><td> İyi bir redaksiyon, sıcak-start Taq polimeraz </td></tr></tbody></table>

wild-tip ve süs Çeşitler arasında ayırt a pcr tabanlı genotiplendirme yöntemi imperata cylindrica</em

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Yabani tip I cylindrica (cogongrass) olumsuz Afrika, Asya, Avrupa, Yeni Zelanda, Okyanusya ve Amerika 1-2 genelinde 73 farklı ülkede tarım ve doğal kaynakları etkileyen, dünyanın en kötü on invaziv bitkilerden biridir. Cogongrass yerli bitki türlerinin büyük bir çeşitlilik yerinden ve sırayla yem ve barınma için yerinden yerli bitki türleri bağlıdır yerli hayvanlarını tehdit hızla yayılan, monodominant standları oluşturur. Sorunun eklemek için, bir süs çeşitli [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] yaygın Imperata cylindrica &#39;Rubra&#39;, Red Baron ve Japon kan otu (JBG) adları altında pazarlanıyor. Bu çeşit varsay steril ve non-invaziv ve onun kırmızı renkli yaprakları için arzu edilen bir süs olarak kabul edilir. Ancak, doğru koşullar altında, JBG canlı tohum üretebilir (Carol Holko 2009, kişisel iletişim) ve i yeşil bir dönebilirsinizBu vahşi tip invaziv çeşitli 4 (Şekil 1) ayırt edici özellikleri üzerine alır gibi cogongrass çoğu zaman ayırt edilemez nvasive formu. Bu tanımlama bile iyi eğitimli bitki taksonomistlerin için morfolojisi zor bir görev kullanarak yapar. Saldırgan bir yeşil fenotipi JBG ile geri dönmesinin de nadir bir olay değildir. Kodlama ve nükleer ve kloroplast hem DNA değişken bölgelerin dizi karşılaştırmalar kullanarak, JBG Maryland, South Carolina, ve Missouri eyaletlerinde içinde yeşil invaziv gecmistir doğruladı. Aktif bir cogongrass istilası var olmadığı JBG kıta ABD&#39;nin hemen her eyaletinde satılan ve dikilmiş oldu. Iyi anlaşılmış değil geri sorunun ölçüde rücu bitkiler belgelenmemiş ve genellikle yok çünkü. Bu molekül protokolünün Uygulama JBG döner tanımlamak için bir yöntem sağlar ve co-meydana gelen, bu çeşitler kalmasına yardımcı birnd muhtemelen melezleştirerek. Cogongrass farklı bir genotip ile geçerken, bir zorunlu outcrosser ve,-rüzgar dağınık canlı üretmek 5-7 geniş mesafelerde cogongrass yayıldı tohumları olabilir. JBG cogongrass göre biraz farklı bir genotip vardır ve cogongrass olan canlı melezler oluşturur mümkün olabilir. Sorunun eklemek için JBG cogongrass 8-10 daha soğuk ve hoşgörülü bir gölge olduğunu ve bu iki çeşit arasındaki gen akışı daha agresif olan melezler oluşturmak için muhtemelen, vahşi tip cogongrass daha cesur, hoşgörülü, soğuk ve gölge. Yabani tip cogongrass anda Güneydoğu ABD&#39;nin dünya çapında 490 milyon hektarın üzerinde, infests iken 500.000 hektarı aşan infests ve hızla kuzeye geniş niş ve coğrafi potansiyeli 3,7,11 nedeniyle yayılır olarak ABD büyük kısmını işgal yeteneğine sahiptir. Genetik bir geçiş potansiyel USDA-APHIS Federal Zehirli Hafta Programı için ciddi bir endişe kaynağıdır. Şu anda, USDA-APHIS devletler wh JBG yasaklarere büyük cogongrass enfestasyonlar (örneğin, Florida, Alabama, Mississippi) vardır. Cogongrass ve JBG dağılımları genişletmek Ancak, bir araya gelen iki çeşit önlenmesi daha zor kanıtlayabilirim. Ayrıca, döner JBG dağılımı henüz bilinmeyen ve morfoloji aracılığıyla bu çeşitler tanımlamak için yeteneği olmayan bazı cogongrass istilalarını JBG döner bir sonucu olabilir. Ne yazık ki, mevcut kimliklenme moleküler yöntemler genellikle alıcı ve masraflı zaman her ikisi de AFLP (Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi) ve DNA dizi analizi, güveniyor. Burada, doğru cogongrass ve JBG dönmek ayırt ilk maliyet-etkin ve güvenilir PCR tabanlı moleküler genotiplendirme yöntemi sunuyoruz.

Biz kloroplast trnL-F boşluk bölge içinde hedef DNA dizisi farklılıklar çeşitler arasındaki farklılaştırmak için çeşitli spesifik PCR primerleri kullanan bir maliyet-etkin ve hızlı moleküler genotipleme protokol sağlar<em&gt; Imperata cylindrica</em&gt; (Cogongrass) sadece morfoloji ile ayırt edilemez. Bu çeşit federal listelenen zararlı ot, cogongrass ve yakından ilgili, yaygın süs çeşitli, ben dahil<em&gt;. cylindrica</em&gt; Var.<em&gt; Koenigii</em&gt; (Japonca kan otu).

Wild-tip ve Süs Çeşitler arasında ayırt A PCR tabanlı Genotiplendirme Yöntemi Imperata cylindrica</em

Yabani tip I. cylindrica (kök otu), dünyadaki en kötü on istilacı bitkiden biridir ve ...'daki tarımsal ve doğal kaynakları olumsuz etkilemektedir.

Bu prosedürün temel amacı, yalnızca morfoloji ile ayırt edilemeyen ve genellikle gon grass olarak adlandırılan Retta cylindrica varyetelerini birbirinden ayırabilen, maliyet etkin ve hızlı bir moleküler genotipleme protokolü sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen gon grass varyetesinden doku tanımlanıp izole edilerek gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, toplanan dokudan nükleer ve plazmid DNA'sının ekstrakte edilmesidir.Ardından, PLAs turn LF bölgesindeki sekans farklarını hedefleyen varyete spesifik primerler ile uygun pozitif ve negatif kontroller kullanılarak, ekstrakte edilen DNA üzerinde polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirilir. Son adım, amplifiye edilmiş PCR ürünlerini görselleştirmek için dört PCR reaksiyonunun her birine jel elektroforezi uygulamaktır. Sonuç olarak, toplanan gon otu varyetesi, jel üzerindeki varyete spesifik PCR ürün bantlarının analizi yoluyla belirlenir. İstilacı bitkiler, hem tarımsal hem de doğal kaynaklara ciddi zararlar vererek Amerika Birleşik Devletleri'ne yıllık yaklaşık 3,4 milyar dolara mal olmaktadır.Cogan otu olarak da bilinen vahşi tip Imperata cylindrica, dünyadaki en kötü 10 istilacı yabancı ot arasında yer almaktadır. Cogan otu, yerli bitki örtüsünü ve dolayısıyla bu bitki örtüsüne bağımlı hayvanları yerinden eden tek türden oluşan stantlar halinde hızla yayılır; bu ot şu anda dünya genelinde 490 milyon hektarda ve Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 500.000 hektarda istilaya neden olmaktadır. Imperata cylindrica'nın süs varyetesi ise yaygın olarak Imperata cylindrica, Arbra, red Baren ve bizim JBG olarak adlandıracağımız Japon kan otu isimleri altında pazarlanmaktadır. Bu varyetenin kısır ve istilacı olmadığı varsayılmakta olup, kırmızı renkli yaprakları nedeniyle tercih edilen bir tür olarak kabul edilmektedir.Belirli koşullar altında, Japon kan çimi canlı tohumlar üretebilir ve yabani tip cogan çiminden ayırt edilemeyen tamamen yeşil bir forma geri dönebilir. Görüleceği üzere, her ikisi de yeşil yapraklara sahiptir ve geleneksel süs çeşitlerinden daha büyük yapraklara sahiptirler. Ek olarak, geri dönmüş ve yabani tip bitkiler daha büyük rizomlara sahiptir ve süs çeşidinin aseksüel üreme potansiyeli artmaktadır.Sürgün verme işlemi, tanımlamanın yalnızca morfoloji yoluyla yapılmasını gerektirir. Bu oldukça zorlayıcı bir görevdir. Moleküler yöntemler, normal görsel yollarla tanımlanamayan istilacı bitkilerin ve bitki materyallerinin doğru bir şekilde ayırt edilmesi için bir araç sağlar.İstilacı bitkilerin yayılmasını ve girişini engellemek için moleküler yöntemler kritik öneme sahiptir. Bu moleküler protokolün uygulanması, Japon kan çimi revertlerini Kogan çiminden doğru bir şekilde ayırt etme imkanı sağlar. Bu protokol, Kogan çimi ile birlikte bulunmayı ve canlı hibritlerin olası oluşumunu önlemeye yardımcı olabilir.Bu tekniğin, amplifiye fragman uzunluk polimorfizmi veya A FLP analizi ve DNA dizileme gibi mevcut tekniklere göre temel avantajı, yabani tip kogan otu ile Japon kan otu varyeteleri arasındaki farkı kolayca ayırt edebilen, oldukça maliyet etkin ve hızlı bir moleküler genotipleme tekniği sunmasıdır. Tekniği, laboratuvarımızdan lisans öğrencisi Joseph Hery uygulamalı olarak gösterecektir. İlk olarak, kogan otunun veya Japon kan otunun yetiştiği ve birbirlerinden ayırt edilmeleri gereken bir sahadan bir örnek belirleyin.Japon kan çimi, parlak kırmızı yapraklarıyla yabani tip Kogan çiminden kolayca ayırt edilir. Ancak, Japon kan çimi revert formu, her ikisinin de süs Japon kan çimine göre daha uzun yeşil yapraklara, daha geniş yaprak alanına ve daha büyük rizomlara sahip olması nedeniyle Kogan çimiyle neredeyse ayırt edilemez. Bu yöntem; taze, dondurulmuş ve yakın zamanda kurutulmuş yaprak dokuları üzerinde uygulanabilir.Dokuların daha sonraki bir tarihte DNA ekstraksiyonu için saklanması gerekiyorsa, en iyi yöntem dokuyu derhal eksi 80 santigrat derecede dondurup saklamaktır. Kuru saklama gerekliyse, dokuyu bir kağıt zarfa yerleştirin ve zarfı oda sıcaklığında susuzlaştırılmış silika jel veya diğer aktif kurutucular içinde saklayın. Taze doku kullanılacaksa, degradasyonu önlemek için DNA'nın toplandıktan sonra üç saat içinde ekstrakte edildiğinden emin olun.Bu prosedür, Kyogen tarafından üretilen DNEZ plants mini kitini, üretici talimatlarına göre ancak küçük bir modifikasyonla kullanmaktadır. Prosedür, 100 miligramdan fazla taze veya dondurulmuş dokunun veya 20 miligramdan fazla kurutulmuş dokunun kullanılabileceği şekilde uyarlanmıştır. İlk olarak, soğutulmuş bir havan ve havan eli kullanarak, sıvı azot ile üç turda 100 miligramdan fazla taze veya dondurulmuş yaprak dokusunu veya 20 miligramdan fazla kuru yaprak dokusunu ince bir toz haline gelene kadar öğütün.Taze veya dondurulmuş dokudan elde edilen dondurulmuş tozu 100 miligramlık alikvotlar halinde tartın. Kuru yaprak dokusu kullanılıyorsa, tozu 20 miligramlık alikvotlar halinde tartın. Bu adımdan sonra, üretici talimatlarına uygun olarak DNA ekstraksiyonunu gerçekleştirin; DNA kalitesi ve miktarı için NanoDrop spektrofotometre testi gibi bir spektrofotometre kullanarak, iyi DNA verimleri microliter başına 50 ile 150 nanogram arasında olmalı ve 260/280 ile 230/280 oranları burada görüldüğü gibi 2,0'a yakın olmalıdır.Standart %1 AROS jeli kullanarak elektroforez gerçekleştirin. DNA konsantrasyonu yüksekse, RNA kontaminasyonuna bağlı olarak çok az veya hiç izleme (streaking)yle beraber 10 KB'den daha büyük, nispeten iri bantların varlığını doğrulayın ve sonraki adımlar için örnekleri mikrolitre başına 70 nanogram olacak şekilde seyreltin. Bu protokolde kırmızı ve yeşil oklarla belirtilen PCR primerleri, Cogan grass ve Japon kan otu genotiplerinin plastered turn LF spacer bölgesi arasındaki sekans farklarına dayanmaktadır.Bu farklılıklar, dikey siyah oklarla belirtilen tek nükleotid polimorfizmleri ile insersiyonlar ve delesyonlar şeklinde ortaya çıkar ve varyeteye özgü primerlerin geliştirilmesine olanak tanır. Primerler benzersiz sekansların bulunduğu bölgelere yerleştirilerek belirlenir; primer sekansları, izole edilen her bir DNA örneği için hazırlanan protokolün yazılı kısmında yer almaktadır. Yazılı protokole uygun olarak, her bir primer seti kullanılarak buz üzerinde 0,2 mililitrelik ince duvarlı PCR tüplerinde iki adet 50 mikrolitrelik PCR reaksiyonu kurun. Eğer DNA konsantrasyonu düşükse, toplam reaksiyon hacminin 50 mikrolitrede kalması için nükleaz içermeyen çift distile su miktarı ayarlanarak her bir reaksiyona daha fazla DNA eklenebilir.DNA örneklerinde bulunan safsızlıkların PCR reaksiyonlarını inhibe edebileceği göz önünde bulundurularak, reaksiyon başına beş mikrolitreden fazla DNA veya toplam hacmin %10'undan fazlası kullanılmamalıdır; tüm PCR reaktiflerinin çalıştığından emin olmak için pozitif kontrolü düzgünce hazırlayın. Pozitif kontrol primerlerini kullanarak, pozitif kontrolle aynı kontrol primer setini ancak ekstre edilmiş DNA yerine çift distile su kullanarak negatif kontrolü hazırlayın; bu noktada, test edilen her örnek için toplam dört PCR reaksiyonu bulunmaktadır. Ardından, ısıtmalı kapaklı bir termosiklatörde, yazılı protokoldeki PCR döngü parametrelerini kullanarak PCR amplifikasyonlarını gerçekleştirin; DNA kalitesine, primerlere, Taq polimeraza veya kullanılan termosiklatör tipine bağlı olarak primer bağlanma sıcaklığı, uzama süreleri ve döngü sayısı için optimizasyon gerekebilir.PCR reaksiyonları tamamlandığında, PCR ürünlerini standart elektroforez kullanarak %1'lik bir jel üzerinde ayırın. Örnekleri, boya önü jelin toplam uzunluğunun dörtte üçüne ulaşana kadar yaklaşık 120 voltta çalıştırın. Jeli UV ışığı altında görselleştirin ve uygun bir DNA fragmanının amplifiye edilip edilmediğini görmek için ortaya çıkan bantları inceleyin.Bu temsili jel; Kogan otu, Japon kan otu ve Japon kan otu revert DNA örneklerinden elde edilen PCR ürünlerinin, Kogan otu ve JBG spesifik primerleri ile birlikte yürütülen elektroforez sonuçlarının yanı sıra turn LF pozitif kontrolünü ve şablon içermeyen negatif kontrolü göstermektedir. Turn LF pozitif kontrol primer seti; Kogan otu, Japon kan otu, Japon kan otu revert ve diğer otlar için aynı derecede iyi çalışır ve 890 baz çifti uzunluğunda bir bant ile sonuçlanır. Eğer tüm PCR reaktifleri DNA kontaminasyonundan arınmışsa, negatif kontrol reaksiyonu bir PCR ürünü ile sonuçlanmayacaktır.Eğer DNA örneği yaban tipi kogan otundan elde edilmişse, Kogan otuna özgü primer setinin kullanıldığı bir PCR reaksiyonu yaklaşık 595 baz çiftinde tek bir bant oluştururken, JBG'ye özgü primerler herhangi bir bant oluşturmayacaktır. Benzer şekilde, eğer DNA örneği JBG veya geri döndürülmüş J-B-G-A-P-C-R reaksiyonundan elde edilmişse, JBG'ye özgü primer setinin kullanımı yaklaşık 594 baz çiftinde tek bir bant oluşturacaktır. Kogan otuna özgü primerler ise herhangi bir bant oluşturmayacaktır.JBG ve geri dönmüş JBG aynı nükleik asit dizisine sahip oldukları için, dolayısıyla aynı bantlanma modellerine sahip olacaklardır. Bununla birlikte, JBG ile JBG revertleri arasındaki morfolojik farklılıklar oldukça belirgindir; bu nedenle PCR sonuçları aynı olsa da, JBG varyeteleri bitki düzeyinde kolayca ayırt edilebilir. PCR ürünlerinin DNA dizilemesi, farklı cogan otu ekotipleri için DNA dizilerindeki olası değişiklikleri tanımlayabilir.Bu tekniğin geliştirilmesi, yabani tip K otu ile onun süs varyetesi olan Japon kan otunun geri dönmüş formu arasında kesin ayrım yapabilen ilk basitleştirilmiş moleküler yöntemi sunmaktadır. Bu protokolü kullananların, elde ettikleri sonuçları bildirmek için bizimle iletişime geçmelerini öneririz. Paylaşılan bu bilgiler, Japon kan otunun dağılımı hakkında bilgi sağlanmasına yardımcı olacaktır.Bu durum aynı zamanda, USDA'deki düzenleyicilerin, oldukça istilacı Cogan otu varyetelerinin yayılımını ve potansiyelle hibridizasyonunu önlemek için gerekebilecek önlemler hakkında bilinçli kararlar vermelerine yardımcı olacaktır.

a-pcr-based-genotyping-method-to-distinguish-between-wild-type

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT PCR) mRNA düzeyleri farklı böcek doku ve gelişim evreleri teşhis etmek için etkili bir araçtır. Bu yazıda farklı larva dokularında tespit mRNA düzeyleri ve istilacı böcek türlerinin, zümrüt kül delici gelişim evreleri QRT-PCR kullanımı göstermektedir.

Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, ve Typhimurium hızlı tespiti için bir multipleks PCR açıklar. Belirli Salmonella serovars, belirli bir serovar O-antijen biyosentezi küme ve flagellin benzersiz genler ve dizileri bir multipleks PCR hedef tespit edilebilir. Serovar hedef allel ilgili özel, boyut amplikonlarının (PCR ürünü) görünümünü dayalı izole Salmonella sonra atanır.

Allelotyping belirlenmesi için bir PCR Salmonella enterica Serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg ve Typhimurium

Burada sunulan Direkt PCR yaklaşım doğrudan arıtılmadan bitki ve hayvan dokusu küçük miktarlarda PCR kolaylaştırır.

Önce DNA Saflaştırma olmadan Bitki ve Hayvan Örnekleri genotiplendirmesi

Burada, RNA örneklerinde genomik DNA (gDNA) kirlilik izleme için bir iletişim kuralı mevcut. Sunulan yöntem astar özel ribozomal DNA (rDNA) gen iç kopya etmek spacer bölge (ITS) için kullanır. Yöntem güvenilir ve hassas algılama DNA kirlenme çoğu Ökaryotlar ve prokaryotlar için uygundur.

DNA kirlenme ribozomal DNA tabanlı RNA örneklerinde değerlendirilmesi

Bu makalede, Genomlarda Yüksek Çözünürlüklü Erime Analizi (HRM) tabanlı Hedef Kaynaklı Lokal Lezyonlar (TILLING) olarak tanımlanan protokolü satılmaktadır. Bu yöntem, DNA dupleksinin erimesi sırasında floresan değişikliklerini kullanır ve hem ekleme/silme (Indel) hem de tek baz ikamesi (SBS) yüksek işlem li tarama için uygundur.

Pirinç Bir TILLING Popülasyonyüksek Çözünürlükte Erime mutasyonları belirlenmesi

Flüoresan mikroskopi ile öz-genotiyon un belirlenmesini birleştiren kayısı(Prunus armeniaca L.) çeşitlerinin tozlaşma gereksinimlerini niçin pcr analizi ile s-genotipinin tanımlanması ile biraraya getiren bir metodoloji salıyoruz.

El-Tozlaşma, Mikroskopi ve Genetik Analizleri Birleştiren Kayısıda Öz ve İnter-(in)Uyumluluk İlişkilerinin Belirlenmesi

Burada sunulan taşınabilir bir qPCR sistemi kullanarak Matricaria chamomilla alan tanımlama için bir protokoldür. Bu kolay gerçeklene kadar yapılan protokol, çiftlikler ve depolar gibi laboratuvar ekipmanı ve uzmanlığına erişimin sınırlı olduğu yerlerdeki bir botanik türün kimliğini doğrulamak için ideal bir yöntemdir.

Taşınabilir QPCR Sistemi ile Matricaria chamomilla Alan Tanımlama

Japon erik tipi melezlerde tozlaşma gereksinimlerinin belirlenmesi için bir metodoloji, floresan mikroskopisi altındaki polen tüplerinin alan ve laboratuvar tozlaşmalarını ve gözlemlerini, S-genotiplerinin PCR tarafından tanımlanması ve tozlayıcıların seçimi için çiçeklenmenin izlenmesi ile birleştiren bir metodoloji açıklanmaktadır.

Fenolojik İzleme, El Tozlaşmaları, Floresan Mikroskopisi ve Moleküler Genotipleme ile Japon Eriğinde Tozlaşma Gereksinimlerinin Oluşturulması

Bu protokol, kendi kendine Caenorhabditis nematodlarının büyük ölçekli ekolojik araştırmalarını gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu yöntemin birincil avantajı, doğadan toplanan nematodlarla ilişkili ekolojik ve moleküler verilerin verimli bir şekilde düzenlenmesi ve analiz edilmesidir.

Kendinden Çıkan Caenorhabditis Nematodlarının Ekolojik Araştırmalarını Gerçekleştirmek için Yüksek Oranda Ölçeklenebilir Bir Yaklaşım

Bu protokol, narenciye çeşitlerinde polen uyumluluğunu ve uyumsuzluğunu belirlemek için hızlı bir yöntem sağlar.

Manuel Polinasyon, Mikroskopi ve S-Genotip Analizleri Kullanılarak Narenciyede Kendini-(In)uyumluluk, Uyumluluk-(In)uyumluluklarının ve Inter-(In)uyumluluklarının belirlenmesi

Öğrenin Imperata cylindrica çeşitlerini ayırt etmek için hızlı ve uygun maliyetli bir PCR tabanlı genotipleme protokolü. Bu yöntem, morfolojik olarak benzer yabani tip ve süs çeşitlerini doğru şekilde tanımlayarak istilacı türlerin yayılmasını önler.

Wild-tip ve Süs Çeşitler arasında ayırt A PCR tabanlı Genotiplendirme Yöntemi Imperata cylindrica

Daha fazla video keşfet