Wild-tip ve Süs Çeşitler arasında ayırt A PCR tabanlı Genotiplendirme Yöntemi Imperata cylindrica

Bu prosedürün temel amacı, tipik olarak gon otu olarak adlandırılan ve yalnızca morfoloji ile ayırt edilemeyen Retta cylindrica çeşitleri arasında ayrım yapabilen uygun maliyetli ve hızlı bir moleküler genotipleme protokolü sağlamaktır. Bu, ilk önce bir gon otu ilgi alanından dokunun tanımlanması ve izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, toplanan dokudan nükleer ve sıvalı DNA'nın çıkarılmasıdır.

Daha sonra polimeraz zincir reaksiyonu, PLA'ların LF bölgesine dönüşmesini hedefleyen dizi farklılıklarını hedefleyen çeşitliliğe özgü primerlerin yanı sıra uygun pozitif ve negatif kontroller kullanılarak ekstrakte edilen DNA üzerinde gerçekleştirilir. Son adım, amplifiye edilmiş PCR ürünlerini görselleştirmek için dört PCR reaksiyonunun her birinde jel elektroforezi gerçekleştirmektir. Sonuç olarak, toplanan gon otu çeşidi, ortaya çıkan çeşide özgü PCR ürün yasaklarının analizi yoluyla belirlenir Jel İstilacı planlar Amerika Birleşik Devletleri'ne yılda yaklaşık 3,4 milyara mal oluyor ve hem tarımsal hem de doğal kaynaklara önemli zararlar veriyor.

Cogan olarak da bilinen yabani tip imparato Electrica, çim, dünyanın en kötü 10 istilacı yabani otundan biridir. Cogan otu, yerli bitki örtüsünün yerini alan mono meşcerelerde hızlı bir yayılma oluşturur ve buna karşılık, bu yerli bitki örtüsüne bağlı olan hayvanlar GaN otu şu anda dünya çapında 490 milyon hektarı ve Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 500.000 hektarı istila etmektedir ve tus centrica'nın süs çeşitliliği tus Centrica isimleri altında yaygın olarak pazarlanmaktadır. Arbra, kırmızı Baren ve Japon kanı, biz buna JBG diyeceğimiz gibi. Bu çeşitlilik varsayılan olarak steril ve invaziv değildir ve kırmızı renkli yaprakları için arzu edilir olarak kabul edilir.

Belirli koşullar altında, Japon kan otu canlı tohumlar üretebilir ve yabani tip cogan otundan ayırt edilemeyen tamamen yeşil bir forma geri dönebilir. Gördüğünüz gibi, her ikisi de yeşil yapraklara sahiptir ve daha büyük yaprakları olan geleneksel süs çeşitlerinden daha büyüktür. Ek olarak, geri döndürülmüş ve yabani tip bitkiler daha büyük rizomlara sahiptir ve süs çeşidi eşeysiz üreme potansiyelini arttırır.

Geri dönüş, yalnızca morfoloji yoluyla tanımlama yapar. Zorlu bir görev. Moleküler yöntemler, normal görsel yollarla tanımlanamayan istilacı bitkileri ve bitki materyallerini doğru bir şekilde ayırt etmek için bir araç sağlar.

Moleküler yöntemler, istilacı bitkilerin yayılmasına ve girişine karşı koruma sağlamak için kritik öneme sahiptir. Bu moleküler protokolün uygulanması, Japon kan otu geri dönüşlerini Kogan otundan doğru bir şekilde ayırt etmek için bir araç sağlar. Bu protokol, Kogan otu ile birlikte ortaya çıkmasını ve olası canlı melezlerin oluşumunu önlemeye yardımcı olabilir.

Bu tekniğin, amplifiye edilmiş parça uzunluğu polimorfizmi veya A FLP analizi ve DNA dizilimi gibi şeyler gibi mevcut tekniklere göre birincil avantajı, yabani tip kogan otu ile Japon kan otu çeşitleri arasındaki farkı kolayca ayırt edebilen çok uygun maliyetli ve hızlı bir moleküler genotipleme tekniği sağlamasıdır. Tekniği göstermek, laboratuvarımızdan bir lisans öğrencisi olan Joseph Hery olacak. İlk olarak, gon otu veya Japon kan otunun büyüdüğü ve birbirinden ayırt edilmesi gereken bir bölgeden bir örnek tanımlayın.

Japon kan otu, parlak kırmızı yaprakları ile yabani tip gon otundan kolayca ayırt edilir. Bununla birlikte, Japon kan otu geri dönüşü, her ikisi de süs Japon kan otundan daha uzun yeşil yapraklara, daha fazla yaprak alanına ve daha büyük rizomlara sahip olduğu için Kogan otundan neredeyse ayırt edilemez. Bu yöntem taze, dondurulmuş ve yakın zamanda kurutulmuş yaprak dokularında kullanılabilir.

Dokuları daha sonraki bir tarihte DNA ekstraksiyonu için saklıyorsanız, en iyi yöntem dokuyu hemen eksi 80 santigrat derecede dondurup saklamaktır. Kuru saklama gerekliyse, dokuyu bir kağıt zarfa koyun ve zarfı oda sıcaklığında susuz silika jel veya diğer aktif kurutucular içinde saklayın. Taze doku kullanılacaksa, bozulmayı önlemek için DNA'nın toplandıktan sonraki üç saat içinde çıkarıldığından emin olun.

Bu prosedür, küçük bir değişiklikle üreticinin talimatlarına göre Kyogen'in DNEZ tesisleri mini kitini kullanır. Burada. Prosedür, 100 miligramdan fazla taze veya donmuş doku veya 20 miligramdan fazla kuru doku kullanılacak şekilde uyarlanmıştır. İlk olarak, 100 miligramdan fazla taze veya donmuş yaprak dokusunu veya 20 miligramdan fazla kuru yaprak dokusunu, soğutulmuş bir havan ve havaneli içinde öğütme ile üç tur sıvı nitrojen kullanarak ince bir toz haline getirin.

Donmuş tozu taze veya donmuş dokudan 100 miligramlık alikotlara tartın. Kuru yaprak dokusu kullanıyorsanız, tozu 20 miligramlık alikotlara tartın. Bu adımdan sonra, NanoDrop spektrofotometre testi gibi bir spektrofotometre kullanarak üreticinin talimatlarına göre DNA ekstraksiyonuna devam edin, DNA, kalite ve miktar iyi DNA verimleri mikrolitre başına 50 ila 150 nanogram arasında olmalı ve iki 60 üzeri iki 80 ve 2 32 80 oranları görüldüğü gibi 2.0'a yakındır. Burada.

Standart% 1 AROS jeli kullanarak elektroforez yapın. DNA konsantrasyonu yüksekse, RNA kontaminasyonundan hiç veya çok az çizgi ile 10 KB'den büyük nispeten büyük bantların varlığını doğrulayın, sonraki adımlar için numuneleri mikrolitre başına 70 nanograma seyreltin. Bu protokolde kullanılan ve kırmızı ve yeşil oklarla gösterilen PCR primerleri, Cogan otunun sıvalı dönüş LF ara parçası bölgesi ile Japon kan otu genotipleri arasındaki dizi farklılıklarına dayanmaktadır.

Bu farklılıklar, tek nükleotid polimorfizmleri ve dikey siyah oklarla gösterilen eklemeler ve silmeler şeklinde gelir ve bu da çeşitliliğe özgü primerlerin geliştirilmesine izin verir. Primerleri benzersiz dizilerin yerlerine yerleştirerek, primer dizileri, her bir izole DNA örneği için protokolün yazılı kısmında yer alır ve her bir primer setini yazılı protokole göre kullanarak ICE üzerinde 0.2 mililitre ince duvarlı PCR tüplerinde iki adet 50 mikrolitre PCR reaksiyonu oluşturur. DNA konsantrasyonu düşükse, toplam reaksiyon hacmi 50 mikrolitre kalacak şekilde nükleaz içermeyen çift distile su miktarı ayarlanırken her reaksiyona daha fazla DNA eklenebilir.

DNA örneklerinde bulunan safsızlıklar, tüm PCR reaktiflerinin çalıştığından emin olmak için PCR reaksiyonlarını inhibe edebileceğinden, reaksiyon başına beş mikrolitreden fazla DNA veya toplam hacmin %10'undan fazlasını kullanmayın, pozitif kontrolü iyi ayarlayın. Pozitif kontrol primerlerini kullanarak, pozitif kontrol ile aynı kontrol primer setini kullanarak negatif kontrolü ayarlayın, ancak bu noktada ekstrakte edilen DNA yerine çift damıtılmış su ile, test edilen her numune için toplam dört PCR reaksiyonu vardır. Daha sonra, PCR Amplifikasyonlarını ısıtmalı bir kapakla donatılmış bir termodöngüleyicide gerçekleştirin, yazılı protokoldeki PCR döngü parametrelerini kullanarak diz çökme sıcaklığı, uzatma süreleri ve döngü sayısı için optimizasyon, DNA primerlerinin kalitesine bağlı olarak gerekebilir polimeraz veya kullanılan termosikler tipi.

PCR reaksiyonları tamamlandıktan sonra, PCR ürünlerini standart elektroforez kullanarak %1'lik bir jel üzerinde ayırın. D cephesi jelin toplam uzunluğunun dörtte üçüne ulaşana kadar numuneleri yaklaşık 120 voltta çalıştırın. Jeli UV ışığı altında görselleştirin ve uygun bir DNA parçasının amplifiye edilip edilmediğini görmek için ortaya çıkan bantları inceleyin.

Bu temsili jel, Kogan otu, Japon kan otu ve Japon kan otundan türetilen PCR ürünlerinin elektroforezinin sonuçlarını, Kogan otu ve JBG'ye özgü primerlerle birleştirilmiş DNA örneklerini geri döndürmenin yanı sıra LF pozitif kontrolünü ve şablon olmayan negatif kontrolü gösterir. Dönüş LF pozitif kontrol astar seti, Cogan otu, Japon kan otu, Japon kan otu geri dönüşü ve diğer otlar için eşit derecede iyi çalışır ve 890 baz çifti olan bir bantla sonuçlanır. Tüm PCR reaktifleri DNA kirleticileri içermezse, negatif kontrol reaksiyonu bir PCR ürünü ile sonuçlanmayacaktır.

DNA örneği yabani tip kogan otundan türetilirse, Kogan otuna özgü primer setini kullanan bir PCR reaksiyonu, yaklaşık 595 baz çiftinde tek bir bantla sonuçlanırken, JBG'ye özgü primerler bant olmamasıyla sonuçlanacaktır. Benzer şekilde, DNA örneği JBG'den türetilmişse veya geri döndürülmüş J-B-G-A-P-C-R reaksiyonuysa, JBG'ye özgü primer setinin kullanılması, yaklaşık 594 baz çiftinde tek bir bantla sonuçlanacaktır. Kogan çimine özgü astarlar ise bant oluşturmaz.

JBG ve geri döndürülmüş JBG aynı nükleik asit dizisine sahip olduğundan, bu nedenle aynı bantlama modellerine sahip olacaklardır. Bununla birlikte, JBG ve JBG geri dönüşleri arasındaki morfolojik farklılıklar oldukça açıktır, bu nedenle PCR sonuçları aynı olsa da, JBG çeşitlerinin bitki düzeyinde ayırt edilmesi kolaydır. PCR ürünlerinin DNA dizilimi, farklı dişli otu ekotipi için DNA dizilerindeki olası değişiklikleri tanımlayabilir.

Bu tekniğin geliştirilmesi, yabani K tipi ile çimen ve süs çeşidi olan Japon kan otunun geri döndürülmüş formunu doğru bir şekilde ayırt edebilen ilk basitleştirilmiş moleküler yöntemi sağlar. Bu protokolün kullanıcılarını, bu protokolün kullanımından elde edilen sonuçları bildirmek için bizimle iletişime geçmeye teşvik ediyoruz. Bu tür paylaşılan bilgiler, Japon kan otunun dağıtımı hakkında bilgi sağlamaya yardımcı olacaktır.

Bu aynı zamanda USDA'daki düzenleyicilerin, son derece istilacı Cogan otu çeşitlerinin yayılmasını ve potansiyel hibridizasyonunu önlemek için gerekli olabilecek eylemler hakkında bilinçli kararlar almasına yardımcı olacaktır.