Name: RNAi Necromenic nematodu Mikroenjeksiyon Gen demonte ve Transgenesis aracılığı ile Pristionchus pacificus /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Öğrenin Pristionchus pacificus nematodlarında mikroenjeksiyon yoluyla RNAi ve transgenesis tekniklerini kullanarak gen fonksiyonlarını manipüle etme yöntemlerini. Bu protokol evrimsel ve davranışsal biyoloji araştırmaları için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar mikroenjeksiyon yanı sıra anonim değerlendirenler anlayışlı görüşleri ile ilgili yardım için RJ Sommer ve X Wang müteşekkiriz. Bu çalışma NIH hibe SC2GM089602 tarafından desteklenmektedir.

1. Transgenesis: DNA hazırlığı <ol><li> Hakim ko-enjeksiyon belirleyicisi: pRL3 [Ppa-PRL-1 (tu92)] PRL3 plazmid görsel olarak başarılı bir dönüşüm olayları tanımlamak için, baskın bir ko-enjeksiyon belirteç . Bu plazmid yakından C. SQT-1 kolajen geni ile ilgili Ppa-PRL-1 geni baskın bir mutant allel (tu92) için kodlar elegans ve wild tip sinüzoidal lokomosyon solucan vücut ekseni 1,5 boyunca saat yönünde büküm hareketleri haline dönüştürür. Dönüştürülmüş hayvan C. kullanılan popüler bir baskın seçim işaretleyici rol-6 (su1006) çok benzer. Geçtiğimiz 20 yıl boyunca elegans. </li><li> Hedef muhabiri transgen: Ppa-egl-4p: GFP Ilgi bir gen dizisi 9 kodlama GFP transkripsiyonel veya translationally bağlantılı olabilir. Bu çalışmada, Ppa-egl-4promoter: GFP (egl-4, cGMP bağımlı protein kinaz) kullanımıçeviri başlangıç ​​upstream 2 kb parçası S. GFP ifade kazandırmaz eğer d belirlemek için pacificus PS312. Bu GFP vektör modifiye ile GFP kodlama bölgeyi içeren intron ve çok amaçlı Ppa-rpl-23 nazik Xiaoyue Wang ve Ralf J. Sommer (Max-Planck Enstitüsü, Tübingen, Almanya, AB) tarafından sağlanan 3 'UTR terminatör 5. </li><li> Genomik DNA: PS312 Ayrıca yabani-tip P. pacificus PS312 genomik DNA, özellikle transgenik F 1, F 2 döl 5 hayvanlar, istikrarlı transgen miras almak için gereklidir . Kararlı F 2 transgenik hatları görülenlere benzer: genomik DNA iki transgenlerin (GFP muhabiri: ko-enjeksiyon işaretleyici PRL-3 ve Ppa-egl-4p) ile karmaşık ekstra kromozom dizileri oluşturur henüz belli değil C. elegans 3. Ancak, aynı cohesi gereksinimi paylaşmak için genomik DNA ve transgenlerin varve çıkıntılar, güçlü konak hücrelerine doğru DNA şanzıman (gDNA Sigma G1N10 kiti kullanılarak hazırlanmıştır) tanıyabilir karmaşık ekstra-kromozomal dizileri oluşumunu göstermektedir. </li><li> DNA sindirimi : GFP vektör DNA ve ko-enjeksiyon işaretleyici pRL3 ve PS312 gDNA uyumlu yapışkan çıkıntılar üretmek için: Kısıtlama enzimler Ppa-egl-4p linearize için kullanılır. Vorteks değil, dokunarak karıştırın. 37 az bir saat boyunca inkübe ° C </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> pRL3 </td><td> 4 mikrogram </td></tr><tr><td> 10xbuffer </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> PstI (10 U / ml) </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Toplam: </td><td> 100 mcL </td></tr><tr><td> Ppa-egl-4p: GFP </td><td> 4 mikrogram </td></tr><tr><td> 10x tampon </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Sali (10 U / ml) </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Toplam: </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> gDNA PS312 </td><td> 10 mikrogram </td></tr><tr><td> 10x tampon </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> PstI'in ve Sal I (10 U / ml) </td><td> Ul 8 </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Toplam: </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table> Tablo 1 Kısıtlama Enzim Digest için karışım. <ol start="5"><li> DNA yağış ve hazırlık <ol><li> 1:10 sodyum asetat (3 M NaCOOCH-3 pH 5.2) ve sindirilmiş ürün% 100 etanol hacmi 2.5X ekle, pelet daha kolay görmek için 20 ng / glikojen ul ekleyin . </li><li> 15 dakika 14.000 rpm'de Santrifüj 4 ° C </li><li> Tippi tarafından süpernatant Durusuyavaş yavaş ng santrifüj tüpü baş aşağı ve daha sonra bir kağıt mendil, dokunarak, pelet, tüpün alt köşesindeki güvenli olduğundan emin ve etanol ücretsiz. </li><li> 1 ml% 75 etanol ekleyin. </li><li> Hemen 4 5 dakika 14.000 rpm az dönmeye ° C </li><li> Yavaş ters santrifüj tüpüne devrilme ve sonra bir kağıt mendil pelet bu tüpün alt köşesindeki güvenli ve emin etanol dokunarak süpernatant Durusu. </li><li> Kuru pelet 5 dakika 14.000 rpm'de santrifüj vakum 25-30 ° C, kuru ve tamamen ücretsiz etanol kadar. </li><li> TE veya steril dH 2 O 30 ul ekleyin ve bir girdap ile 4 ° C karıştırma kısa bir süre önce bir gece bekletin. </li><li> Tablo 2, enjeksiyon karışımı enjeksiyon için her saflaştırılmış DNA nasıl oluşturulacağı anlatılmaktadır. </li><li> -20 ° C'de muhafaza Enjeksiyon karışımı çözündükten sonra olabilir enkaz parçacıklar kurtulmak için tüp 5 dakika 14.000 rpm'de aşağı doğru döndürünenjeksiyon iğnesi tıkayabilir. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Genetik materyal </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> Ppa-egl-4p: GFP (Sali) </td><td> &gt; 5 ng / ul (0.1-10ng/μl) </td></tr><tr><td> pRL3 (PstI) </td><td> &gt; 1 ng / ml </td></tr><tr><td> gDNA PS312 (PstI + Sali) </td><td> &gt; 60 ng / ml </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Toplam: </td><td> 30 ul </td></tr></tbody></table> (Tablo 2). Ppa-PRL-1 enjeksiyon karışımı 2. RNA Girişim: in vitro çift zincirli RNA sentezi <ol><li> PCR ilgi gen yükseltmek için kullanın. RHL091 5'-agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC 3 '(BamHI site) ve RHL092 5'-tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3' (PstI site) 464 bp genomik frag yükseltmek için kullanılır.Ppa-PRL-1 (tu92) aleli içeren pRL3 vektör Ment (konum 3-466). </li><li> BamHI ve PstI ile PCR ürünü Digest. </li><li> BamHI / PstI pL4440 RNAi besleme vektör 2 sindirilir parçası Arter. </li><li> Yetkili hücrelerin içine eklenen vektör Dönüşümü ve Ampisilin LB medya levhalar (50 mg / ml) onları büyümek. </li><li> T7 primerler kullanılarak PCR ile başarıyla takılı vektör seçin. </li><li> BLOK-IT RNAi sentezi kiti (Invitrogen) kullanarak) çift iplikli RNA dsRNA yapmak için PRL-1 geni içeren PCR ürünü çevrili T7 kullanın. </li><li> Kadar 1 enjeksiyon için mikrogram / ul&gt; 200 ng / ml, dsRNA konsantrasyonu en iyi. </li><li> -20 ° C'de muhafaza Enjeksiyon karışımı çözündükten sonra, bir iğne tıkayabilir enkaz parçacıkların kurtulmak için tüp 5 dakika 14.000 rpm'de dönerler. </li></ol> 3. Mikroenjeksiyon: transgenlerin ve / veya dsRNA enjeksiyon Protokolü <ol><li> Enjeksiyon İğnesi <ol><li> Sıcaklığı: Narishige iğne çektirmesi (PC-10 model #) ayarlayın <ol><li> Alt düğmeyi çevirin "No.2 Isıtıcı." </li><li> "No.2 Isıtıcı Ayarı" Turn. paneli kadar okur topuzu 55,0-60,0 ° C değişen uzunluklarda konik iğne ucu. </li></ol></li><li> (Bir adım iğne çeker) "Adım 1" geri altındaki düğmeyi çevirin. </li><li> Iğne odasına yükleyin ve güvenli olduğundan emin olun. </li><li> "Başlat" düğmesini (kırmızı düğme) basın ve iğne (bu iki zıt yönlerde aynı iğne yapmak gerekir) tüm ağırlıkları ile çekilmesine izin verir. </li><li> Iğne, iğneler üzerinde biriken tozu önlemek için Play-Doh ile sabitleniyor plastik bir kültür plaka oda ve mağaza çıkarın. </li></ol></li><li> Montaj Pedleri <ol><li> 1,5 ml santrifüj tüpüne, 1 ml H 2 O Noble Agar 0,02 g ekleyerek% 2 Noble Agar çözüm Agar, 4 ° C ile bir yıl kadar saklanabilir. </li><li> İyice karıştırın ve&gt; 88 ° C'ye ayarlanmış bir ısı bloğu agar eritebilir </li><li> 1 ml mikropipet kullanarak, (Fisher, 12-544-F) sıvı% 2 Noble Agar bir damla cam slayt ortasına yerleştirin. </li><li> Damla üstünde başka bir cam slayt koyarak düzleştirin. </li><li> "Bırak Adım" Beş cam slayt bir katman kalmayıncaya kadar tekrarlayın. </li><li> Her cam sürgülü cam slayt çıkarın birbirlerine slaytlar. </li><li> Kuru bir elektrikli fırında 70 cam slaytlar agar ped düzleştirmek ° C gecede 4 saat (ya da oda sıcaklığında gece). </li><li> Ileride kullanmak için birden fazla Enjeksiyon pedleri ve mağaza olun. </li></ol></li><li> Hermaphroditic gonadlar içine mikroenjeksiyon </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. P. şematik çizim pacificus anatomi net çekirdekli hücreler dişi germ hücreleri (oosit) ve gri gölgeli kısmı bağırsak. Sadece bir distal anterior gonad gösterilirama iki distal gonadlar, gövde ortasında yakın dorsal birbirlerine çapraz dikkat edin. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Görüntüleri mikroenjeksiyon, (A) enjeksiyon iğne ucu çekti kılcal parçasının aşırı sağ bir çizgi ile odak . Keskin bir nokta hala korurken, bu kenarı iğne ucu hafifçe dokunarak, iğne ucu ayrılmalıyız. (B) üst içine iğne ekler sadece ilk enjeksiyon için bağırsak eğriliği yukarıdaki gonaden. (C) altına iğne ekler ikinci enjeksiyon için sadece gut eğrilik altında gonaden. <ol start="3"><li><ol><li> Kontrast ve DIC kesme ayarı hermafrodit gonadlar görüntülemek için ideal olduğundan emin olun. </li><li> Çekti kılcal iğne içine enjeksiyon karışımı 1.0-2.0 ul yükleyin. </li><li> Mikroenjeksiyon manipülatör iğne yerleştirin; nitrojen tankı basınç göstergeleri ideal koşulları belirlenmiş olmalıdır (10-20 psi0.5-1 saniye süreyle). </li><li> Iğne ucu bir slayt (Şekil 2A) yerleştirilen, ince çekti kılcal tüp kenarına hafifçe dokunarak kırın. <ol><li> İğne kesici slayt çekti petrol bir damla cam bir slayt üzerine yerleştirilen kapiller ince parçası </li></ol></li><li> İğne sonra (P. pacificus onlar kuru önce enjeksiyon için 5 dakikalık bir pencere var ve ölmek) pad solucan almak ise atıl bir konumda yer olabilir. </li><li> J4-genç erişkin solucanlar dolu bir tabak kullanarak, tüm solucanlar OP50 bakteriyel çim kapağı sadece yeterli parafin yağı (ağır) dökün. </li><li> Pick bir solucan ve enjeksiyon pad üzerine yerleştirin. </li><li> Iğne ve iğne (Şekil 2B, 2C) uzak vulva yönde pozisyon solucan gonad mikroskop solucan ile cam slayt yerleştirin. </li><li> Mikroskop görünümü konumu iğne indirin. </li><li> Aynı odak düzlemi (Şekil 2B) üst gonad ve iğne yerleştirin.</li><li> Yavaşça solucan Poke ve pompa enjeksiyon karışımı; distal uç doğru ayıran ooctyes (transgen veya dsRNA teslim optimize etmek için başarılı bir enjeksiyon gösterir, enjeksiyon üzerine distal yakın olana kadar devam gonad genişleme dalgası görmelisiniz ucu). </li><li> Yeniden konumlandırmak alt gonad ve tekrar enjeksiyon enjekte etmek için iğne, bu gonad oositlerin yayılması olmayacaktır bağırsak altında ve (Şekil 2C) ulaşmak için böylece daha zor ancak. </li><li> Normal görünümlü solucan enjeksiyondan sonra başarılı bir enjeksiyon gösterir; (vulva dışarı çıkıntılı ya da vücut boşluğunun içine attı) herhangi bir hasarlı gonadlar olmamalıdır. </li><li> Rölanti iğne geri yerleştirin. </li><li> Solucan kurtarmak için hazırlayın. </li><li> M9 tampon enjekte solucan yerleştirilen ped üzerine bir damla (0.5 ul) ekleyin. </li><li> OP50 bakteri tercihinizi kullanarak, solucan OP50 ile dokunma, ve sopa olmalıdır. We, ağız pipeti kullanmayın. </li><li> Solucan tabağa OP50 50 ul noktalar ile seeded yerleştirin, 2-4 solucanlar gibi plakalar kurtarıldı olabilir. </li></ol></li><li> Transgenesis için enjeksiyon sonrası Depolama ve Tarama <ol><li> Mağaza 20 (P 0) solucanlar enjekte ° C ~ 4 gün yumurtalarını ve F 1 büyüyecek. </li><li> Seçili fenotip (transgenesis Ppa-PRL-1 hakim işaretleyici ifade yuvarlanan hayvanlar için, arama ekran) için dördüncü gününde Ekran solucanlar. </li><li> Tek bağımsız F 1 Pick 25 yeni numaralı seribaşı plaka ve saklamak için gözlenen bir fenotip ile hayvanlar ° C; bu sıcaklık F 1 istikrarlı çizgilerin oluşumunu teşvik eder ' s. </li><li> Tek F 2 F 1 hatlarından bağımsız. Bireysel F 2 satır benzer transgen aktarım hızlarına sahip. Biz genellikle&gt; 15 elde F dönüştürülmüş F 1 hayvan başına 2 satır. </li><li> 25 ° C'de sonraki nesillere Mağaza </li><li> Her bir hat için: silindirleri iletim hızı genellikle bu hedef transgen ekspresyon seviyesi (GFP: Ppa-egl-4p) belirlemek için şu anda gerekli olan F 4 nesil sonra sabit kalır. GFP ifade baskın rulo fenotip penetrans derecesi ile ilişkili olmayabilir. </li></ol></li><li> RNAi fenotipleri için enjeksiyon sonrası Depolama ve Tarama <ol><li> Mağaza 20 (P 0) solucanlar enjekte ° C ~ 4 gün yattı ve F 1 büyümek için. </li><li> Ekran F seçilen fenotip (RNAi demonte fenotipi Ppa-PRL-1 fenotip kaybı bizim durumumuzda, hedef gen aktivitesinin kaybı ile ilişkili olabilir penetrant fenotipleri için arama için ekran) dördüncü gününde 1 solucanlar. </li><li> Deneyimlerimize göre, non-silindiri demonte fenotip F 2&gt;% 97 kaybolur. </li></ol></li></ol> 4. Temsilcisi sonuçları: Transgenesis p "&gt; 1 Sonuç <table border="1"><tbody><tr><td> Oturum </td><td> P 0 Injected </td><td> F 1 Silindirler </td><td> % Transgenik F 2 </td><td> Ortalama% iletim F 2 sonra </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 2 </td><td> (Hat 1) 0% (2 hat)% 13 </td><td> NA % 13 ± 10 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 40 </td><td> 1 * </td><td> (3 hat)% 0 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> % 0 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> (4 hat)% 0 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> % 0 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> % 26 (5 hat) </td><td> % 22 ± 10 </td></tr></tbody></table>içeriği "&gt; çapraz vermedi * makaralı bir erkek; NA: Uygulanabilir değil : GFP (Sal I sindirilir), pRL3 (rulo) (PstI'in sindirilir) ve gDNA PS312 (PstI ve Sali sindirilir): Tablo 3 Sonuçları Ppa-egl-4p enjekte PS312. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. (A) wild tip (B, C) ​​istikrarlı bir F 4 pRL3; Ppa-egl-4p:: nöron GFP ifade baş gösteren GFP transgenik hattı. 2. RNA girişim sonucu <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. RNA PRL-1 mutantlar "yuvarlanan" hareketin komple demonte (A) PRL-1 rulo kazanç fonksiyon-mutant tu92 enjekte etti. (B) PRL-1 mutant sergi, normal wild tip duruş ve hareket "nakavt". (C) PRL-1 (alt) da uzun b Injecteddaha ody PRL-1 mutant (üstte). (D) uzun vücut enjekte PRL-1 (alt) (üst) wild tip PS312 daha uzun da. Uzun vücut fenotip aynı zamanda rol-5 C. (SQT-1) RNAi demonte gözlendi elegans N2 (veriler gösterilmemiştir). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> rulo </td><td> non-roll </td></tr><tr><td> Bir PRL-1 dsRNA (200 ng / ul) </td><td> 13 </td><td> 21 </td></tr><tr><td> Yatak PRL-1 dsRNA (ng / ul 1000) </td><td> 9 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> kontrol </td><td> 20 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tablo 4 Ppa-PRL-1 dsRNA enjeksiyonları özeti. (A) [dsRNA] = 200 ng / ul; (B) [dsRNA] = 1000 ng / ul. P = 0.0019 ve 0.041, sırasıyla 200 ve 1000 ng / ul enjeksiyonları için iki kuyruklu Fisher Exact Testi,,.

<ol><li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhringer%2C+J+%22Wormbook%22">Wormbook</a>. , (2006).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strongyloides+stercoralis%3A+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3%27+UTR%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li>
<li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li>
<li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pristionchus+pacificus%3A+a+well-rounded+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li>
<li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li>
<li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution%3A+development%2C+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Worm+Lab%3A+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li>
<li>Evans, T. C. Transformation and Microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvans%2C+TC+%22Wormbook%22">Wormbook</a>. , (2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

P. pacificus popülasyonları dünya çapında çeşitli bokböceği böcek türleri ile yakın ilişkisi bulunan ve serbest yaşayan ve paraziter nematod arasındaki ara bir model nematod . P. gücü gelişmekte olan bir model organizma olarak pacificus tarafsız ileri genetik ekranlarını izole mutantlar teşvik pozisyonel haritalama, genetik ve fiziksel haritalar entegrasyonu yatıyordu (yani sadece daha önce C. elegans karakterize aday genler için) 6,10. Ancak, C. elegans g...

<table border="1"><tbody><tr><th> Ürün: </th><th> Katalog #: </th><th> Faaliyet alanı: </th></tr><tr><td> DMI3000 Enjeksiyon mikroskop </td><td> DMI3000 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Mikroenjektör manipülatör (Direct drive) </td><td> Narashige BC-3 Rotil </td><td> TriTech Araştırma </td></tr><tr><td> İğne Çektirme </td><td> Narashige PC-10 </td><td> TriTech Araştırma </td></tr><tr><td> Mikroenjektör ™ All-Dijital Multi-basınç sistemi </td><td> Narashige MINJ-D </td><td> TriTech Araştırma </td></tr><tr><td> GeneElute ™ Memeli Genomik DNA Miniprep Seti </td><td> G1N70 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> pJet Klonlama Jet kiti </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET plazmid Miniprep kiti </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> DNA Clean &amp; Konsantratörü ™ </td><td> D4005 </td><td> ZYMO Araştırma </td></tr><tr><td> BLOK-IT ™ RNAi TOPO ® transkripsiyon kiti </td><td> K3500-01 ve K3650-01 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Difco ™ Agar Noble </td><td> DF0142-15-2 </td><td> Fisher bilimsel </td></tr><tr><td> Mikroskop cam kapak (1.5 - 0,16 - 0,19 mm kalınlığında; Boyut: 50 x 45mm) </td><td> 12-554-F </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Cam kılcal damarlar (filament) </td><td> 615000 </td><td> AM sistemleri </td></tr><tr><td> Parafin Yağı (Ağır) </td><td> O122-1 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> AC20651-5000 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> M80-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr></tbody></table>

rnai necromenic nematodu mikroenjeksiyon gen demonte ve transgenesis aracılığı ile pristionchus pacificus</em

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNA girişim ve istikrarlı transgenesis gen fonksiyonu ve ifade analizleri derinlemesine daha fazla, tamamen sıralı genomların elde birçok türün özellikle anatomi ve organizmanın moleküler hücre biyolojisi nedeniyle sınırlı kalmaktadır. Gelişmekte olan model organizmalar için gittikçe daha uygun fiyatlı olmasına rağmen Örneğin, stably Caenorhabditis olmayan türlerin transgenik hatları bulaşan Caenorhabditis elegans 3, taç grup Caenorhabditis dışında Strongyloides stercoralis 4 ve Pristionchus pacificus 5 istisna ile, bu aldatıcı filumun (Nematoda) bildirilmiştir değil. P. genişleyen rolünü kolaylaştırmak için çalışmada, gelişme, evrim, ve davranış 6-7 pacificus, biz burada, transgenik hayvanlar ve gen RNAi tarafından yıkmak yapmak için mikroenjeksiyon kullanmak için geçerli yöntemleri açıklanmaktadır. Gonadlar gibi <em&gt; C. elegans ve diğer birçok nematod, P. gonadlar pacificus syncitial ve doğrudan mikroenjeksiyon tarafından teslim oosit içine DNA ve RNA içeren yeteneğine sahip. C. aksine P. de elegans Ancak, istikrarlı transgen miras ve somatik ifade pacificus hedef transgenlerin ve coinjection belirteçler 5 biter tamamlayıcı endonükleaz ile sindirilir kendini genomik DNA eklenmesini gerektirir. Ayrıca taşıyıcı genomik DNA Strongyloides stercoralis 4 ve C germ hücreleri transgen ifade gereksinimi için benzer elegans. Ancak, bu hayvanların kendi genomik DNA için spesifik bir gereklilik ise açık değildir, çünkü P. pacificus soma karmaşık olmayan çok kopyalı genlerin susturulması ya da çok verimli P. içinde ekstrakromozomal diziler pacificus mitoz sırasında uygun kinetochore montaj için genomik dizileri gerektirir. Iki kollu (ventral göççift ​​cinsiyetli olarak didelphic) gonadlar, bireysel solucanlar 8 hem de gonadlar enjekte yeteneği daha da zorlaştırmaktadır. Ayrıca demonte haddeleme olmayan F 1 döl elde etmek için çift iplikli RNA (dsRNA) gonadlar içine enjekte edilerek baskın bir mutant (rulo, tu92) mikroenjeksiyon kullanımı göstermektedir. C. aksine elegans, ancak diğer pek çok nematod gibi, P. pacificus PS312 besleme ve iliklerine ve bu nedenle dsRNA syncitial gonadlar içine mikroenjeksiyon tarafından uygulanmalıdır yoluyla sistemik RNAi açık değildir. Bu çalışmada, biz Ppa-egl-4 organizatörü dönüştürmek için gerekli olan mikroenjeksiyon işlemi tanımlamak için umut: GFP füzyon muhabir ve demonte baskın bir rulo PRL-1 (tu92) mutant görsel bilgilendirici bir protokoldür.

RNAi spesifik mRNA transkript 1-2 demonte model organizmalar, transgenesis gen işlevleri işleyebilirsiniz. Bu protokol, necromenic nematod içine stably iletilen DNA ve geçici çift iplikli RNA tanıtmak için gerekli teknikleri göstermek için hedefliyor<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;, Evrimsel gelişim ve davranış biyolojisi çalışmaları için.

RNAi Necromenic nematodu Mikroenjeksiyon Gen demonte ve Transgenesis aracılığı ile Pristionchus pacificus</em

Gelişmekte olan model organizmaların tamamen dizilenmiş genomlar elde etmesi giderek daha uygun maliyetli hale gelse de, daha derinlemesine gen fonksiyonu ve ekspresyon...

Bu prosedürün genel amacı, Priyanka Pacificus nematodlarında yabancı DNA'yı başarıyla transforme etmek ve gen fonksiyonunu baskılamaktır. Transgenez için, uyumlu yapışkan uçlara sahip uygun genomik DNA'yı hazırlayarak başlayın.RNA interferansı için, çift sarmallı RNA transkripsiyon kiti kullanarak ilgilenilen geni sentezleyin. Ardından, PRIs DIANCA pacificus goadlarını DNA veya çift sarmallı RNA ile mikroenjekte edin. Transgenez için F1 popülasyonunu seçilen marker fenotipi açısından; RNA interferansı için ise knockdown fenotipi açısından tarayın ve seçin.Floresan mikroskobu kullanarak GFP raporlayıcısı aracılığıyla spesifik gen ekspresyonlarını gösteren sonuçlar elde etmek için F2 transgenik solucanların sonuçlarını izlemeye devam edin. Merhaba, ben California State University of Northridge'den Ray Hong; bu demonstrasyon, pristi spesifik nematodlarda genetik manipülasyon için izlenecek adımları ana hatlarıyla açıklayacaktır. Gelişmekte olan bir model organizmada RNAi ve transgenez gerçekleştirilerek, gen fonksiyonları ve ekspresyonları karakterize edilmek suretiyle gelişimsel biyoloji ve davranış hakkındaki temel sorular yanıtlanabilir.Bu yöntemi ilk kez kullanacak kişilerin, solu

rnai-mediated-gene-knockdown-transgenesis-microinjection-necromenic

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, transgenik C. elegans suşları oluşturmanın yaygın bir yöntemi olan mikroenjeksiyon açıklanmaktadır. Örnekte, CRISPR bazlarının gen düzenlemesi için bir ribonükleoprotein (RNP) kompleksini tanıtmak için kullanılan mikroenjeksiyonu göreceğiz.

Gonad Mikroenjeksiyonu: C. elegans'ın Germ Hattına Doğrudan Bileşik Verme Yöntemi

Akdeniz meyve sineği (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) dünya çapında bir tarım zararlısıdır. Biyolojisinin daha derin bir şekilde anlaşılması, medfly popülasyonlarını kontrol etmenin ve böylece ekonomik etkiyi azaltmanın anahtarıdır. Embriyo mikroenjeksiyonu, bu türde hem germ hattı transformasyonuna hem de ters genetik çalışmalara olanak sağlayan temel bir araçtır.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Burada, laboratuarda bir ara-germ böceği, Dermestes maculatus (D. maculatus) yetiştirme için protokolleri sunuyoruz. Biz de bu türün gen fonksiyonunu incelemek için embriyonik fenotipleri analiz etmek için embriyonik ve ebeveyn RNAi için protokolleri ve yöntemleri paylaşır.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı, Dermestes maculatus

Mikroenjeksiyon Nasonia vitripennis embriyo kalıtsal genom değişiklikler oluşturmak için temel bir yöntemdir. Burada açıklanan mikroenjeksiyon ve büyük ölçüde bu organizma gelecekteki genom manipülasyon kolaylaştıracaktır Nasonia vitripennis embriyo nakli için detaylı bir işlemdir.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

Burada iletişim kuralları için toplama ve microinjecting precellular Batı Mısır rootworm embriyo germline dönüştürme ve CRISPR/Cas9-genom düzenleme gibi fonksiyonel genomik deneyleri yapmak amacıyla mevcut.

Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme

RNA paraziti, gen ekspresyonunu belirli gelişimsel evrelerde manipüle etmek için yaygın olarak uygulanabilir ve güçlü bir tekniktir. Burada, sudalış böceği Thermonectus marmoratusbu tekniğiuygulamak için gerekli adımları açıklar , gen dizilerinin edinimi gelen yapı veya davranışı etkileyen genlerin yıkılması.

Belirli Gelişimsel Zaman Noktalarında Gen İfadesi Manipüle Etmek Için Güçlü Bir Araç Olarak Su Böcekleri RNA Girişim

Burada, Nasonia vitripennis'te etkili pupal ve yetişkin enjeksiyonları için yöntemleri embriyo mikroenjeksiyonuna erişilebilir alternatifler olarak tanımlıyoruz ve RNA paraziti (RNAi) yoluyla RNA susturma veya CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi yoluyla gen nakavt kullanarak ilgi genlerinin fonksiyonel analizini sağlıyoruz.

Nasonia vitripennis'te RNAi ve CRISPR Gen Düzenleme için Pupal ve Yetişkin Enjeksiyonları

Burada, gen fonksiyonlarının incelenmesini kolaylaştırmak için Bursaphelenchus xylophilus'ta RNA girişiminin ayrıntılı bir ıslatma yöntemini tanıtıyoruz.

RNA Girişiminin Çam Ağacı Nematodunda Uygulanması, Bursaphelenchus xylophilus

Entomopatojenik nematodlar bakterilerle simbiyoz içinde yaşarlar ve birlikte doğuştan gelen bağışıklık sistemlerini zayıflatarak böcekleri başarılı bir şekilde enfekte ederler. Nematod enfeksiyonunun genetik temeli üzerine araştırmaları teşvik etmek için, entomopatojenik nematodları korumak ve genetik olarak manipüle etmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Entomopatojenik Nematodların Kültürlenmesi ve Genetik Olarak Manipüle Edilmesi

Bu makale, entomopatonik (EPN: böcek-parazitik) nematod ve gelişmekte olan bir genetik model olan Steinernema hermaphroditum'da CRISPR-Cas9 aracılı genom mühendisliğini göstermektedir. Anlatılan teknoloji, mutantların yaratılması için faydalıdır ve nematod biyolojisinde karşılıklı ve parazitik simbiyozla ilgili gen fonksiyonlarının aydınlanmasını sağlar.

Entomopatotik Steinernema hermaphroditum nematodunda CRISPR-Cas9 tabanlı mutageze ve mutant hatların korunması

Öğrenin Pristionchus pacificus nematodlarında mikroenjeksiyon yoluyla RNAi ve transgenesis tekniklerini kullanarak gen fonksiyonlarını manipüle etme yöntemlerini. Bu protokol evrimsel ve davranışsal biyoloji araştırmaları için değerlidir.

RNAi Necromenic nematodu Mikroenjeksiyon Gen demonte ve Transgenesis aracılığı ile Pristionchus pacificus

Daha fazla video keşfet