RNAi Necromenic nematodu Mikroenjeksiyon Gen demonte ve Transgenesis aracılığı ile Pristionchus pacificus

Bu prosedürün genel amacı, Priyanka Pacificus nematodlarında yabancı DNA'yı başarıyla transforme etmek ve gen fonksiyonunu baskılamaktır. Transgenez için, uyumlu yapışkan uçlara sahip uygun genomik DNA'yı hazırlayarak başlayın.

RNA interferansı için, çift sarmallı RNA transkripsiyon kiti kullanarak ilgilenilen geni sentezleyin. Ardından, PRIs DIANCA pacificus goadlarını DNA veya çift sarmallı RNA ile mikroenjekte edin. Transgenez için F1 popülasyonunu seçilen marker fenotipi açısından; RNA interferansı için ise knockdown fenotipi açısından tarayın ve seçin.

Floresan mikroskobu kullanarak GFP raporlayıcısı aracılığıyla spesifik gen ekspresyonlarını gösteren sonuçlar elde etmek için F2 transgenik solucanların sonuçlarını izlemeye devam edin. Merhaba, ben California State University of Northridge'den Ray Hong; bu demonstrasyon, pristi spesifik nematodlarda genetik manipülasyon için izlenecek adımları ana hatlarıyla açıklayacaktır. Gelişmekte olan bir model organizmada RNAi ve transgenez gerçekleştirilerek, gen fonksiyonları ve ekspresyonları karakterize edilmek suretiyle gelişimsel biyoloji ve davranış hakkındaki temel sorular yanıtlanabilir.

Bu yöntemi ilk kez kullanacak kişilerin, solucanın enjeksiyon pedine nasıl yerleştirileceğini ve go nats'ların görünür olduğu doğru odak düzleminde solucuğa nasıl enjeksiyon yapılacağını izlemesi faydalı olacaktır. Ganlar'ın aksine, goad'lar C. elegans'a özgüdür; çünkü goad'lar dorsal olarak birbirlerini keser ve nematod geç J4 evresinden yetişkinliğe geliştikçe zamanla göç ederler. Ayrıca, enjeksiyon karışımınızı hazırlamak için transgenlerinize ve ko-enjeksiyon markörünüze, uyumlu restriksiyon enzimleri ile sindirilmiş genomik DNA eklemelisiniz.

Laboratuvarımdaki Jessica Tek Nokta laboratuvarında, özellikle transgenez için PRIs vakasındaki mikroenjeksiyon gösterilecektir. Enjeksiyon için 3D NA konstrüktları, baskın eş-enjeksiyon markeri ile birlikte gereklidir. Hedef raporlayıcı transgen ve genomik D-N-A-D-N-A konstrüktları, uyumlu restriksiyon enzimleri ile sindirilir. DNA konstrüktları, bir etanol çöktürme protokolü kullanılarak toplanır.Çağrı.

Enjeksiyon karışımı tabloda listelenen konsantrasyonlarda hazırlanır. Azot tankının basınç göstergesi ayarlarını kontrol edin. Şimdi iğneye bir ila iki mikrolitre enjeksiyon karışımı yükleyin.

İğneyi mikroenjeksiyon manipülatörüne yerleştirin. İğne ucunu, bir lam üzerine yerleştirilmiş ince çekilmiş bir kapiler tüpün kenarına hafifçe dokundurarak kırın ve boşta bir konuma getirin. Şimdi, dört genç yetişkin solucanın bulunduğu plakayı kaplayacak şekilde parafin yağı dökün.

Tek bir solucan seçin ve bunu bir enjeksiyon pedine aktarın. Mikroskop altında, vulva iğneden uzak olacak şekilde solucanın gonadını iğne yönünde konumlandırın. Şimdi iğneyi mikroskop görüşündeki konuma indirin.

Üst gonadı ve iğneyi aynı odak düzlemine getirin. Solucanı nazikçe delin ve enjeksiyon karışımını pompalayın. Başarılı bir enjeksiyonun göstergesi olan yumurtaların distal uca doğru ayrıldığını gözlemleyin.

Alt gonadı enjekte etmek için iğneyi yeniden konumlandırın ve enjeksiyonu tekrarlayın. Bu gonad bağırsak altında olduğu için yumurtaların yayılımı görülmeyecek ve bu nedenle enjeksiyonun başarısını ölçmek daha zor olacaktır. Bununla birlikte, enjeksiyon sonrası solucan, dışarı çıkmış gonadlar olmadan sağlam kalmalıdır.

İğneyi tekrar bekleme konumuna getirin. Bir iğne ucuyla alınan bazı OP 50 bakterilerini kullanarak solucanı kurtarmak için bir damla M nine tamponu ekleyin. Solucanın yapışması için onu OP 50 ile temas ettirin.

Şimdi solucanı, üzerinde 50 µL'lik OP 50 damlacıkları bulunan bir plakaya aktarın. Enjekte edilen solucanları, F1 neslinin yumurtlaması ve büyümesi için yaklaşık dört gün boyunca 20 °C'de saklayın. Ardından solucanları seçilen fenotip için tarayın.

Gözlemlenen fenotipe sahip tekil F birlerini yeni ekilmiş plakaya seçin ve 25 °C'de saklayın. Son olarak, transgenik hatlar için tekil F ikilerini bireysel plakalara aktarın. Sonraki nesilleri 20 °C'de saklayın.

RNAi ve transgenez yoluyla organizma düzeyinde gen fonksiyonunun manipülasyonu, evrimsel gelişimsel biyoloji için Ppac pacificus modelinin temel yönleridir; soldaki vahşi tip solucanla karşılaştırıldığında, stabil F4 PPR L3 transgenik hattı, kafa nöronlarında GFP ekspresyonu gösteren dominant bir "roller" ile sonuçlanır. Buna karşılık, bu RNAi deneyi, PRL1 roller kazanım fonksiyonu mutantı TU 92'de genellikle gözlemlenen yuvarlanma lokomosyonunun tamamen nakavt olduğu PRL1 mutantlarını üretir. Uzmanlaşıldığında, her bir enjeksiyon beş dakika içinde tamamlanabilir. Bağımsız F1 transgenik roller hatlarından gelen tüm F2'lerin, bağımsız F2 projenileri oluşturmak için tek tek seçilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Bunun nedeni, F₂ hatları arasında GFP ekspresyonunun oldukça değişken olduğunu ve roller fenotipinin aktarımının G ekspresyon seviyesi ile korelasyon göstermediğini tespit etmiş olmamızdır.