Name: Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Öğrenin fare kalbinde optik haritalama yöntemiyle aksiyon potansiyelleri ve kalsiyum geçişlerini eşzamanlı olarak nasıl kaydedebilirsiniz. Bu teknik aritmi araştırmalarında yüksek uzamsal çözünürlük sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

NIH R01 HL085369 verir.

1. Gelişmiş stok çözümler hazırlanması <ol><li> Tyrode çözümü (16x) iki stok çözelti deiyonize su önceden hazırlayın ve 4 saklayın ° C: <ol class="lalpha"><li> Menkul Kıymetler (119,872 g / L NaCl, 3.056 g / L CaCl 2 (2H 2 O), 5,6 g / L KCl, 2,6274 g / L NaH 2 PO 4, 3,408 g / L MgCl 2 (6H 2 O), ( Fisher Bilimsel, Fair Lawn, NJ)); </li><li> Stok II (26,88 gr / L NaHCO3 (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)). </li></ol></li><li> Floresan boyalar stok çözümleri hazırlayın. Tekrarlanan dondurma ve çözme önlemek için, -20 ° C, bir deney için yeterli hem de boyaların 30 ul alikotları depolamak: <ol class="lalpha"><li> Gerilim duyarlı boya RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA) stok solüsyonu, 1.25 mg / ml dimetil sülfoksit (DMSO, Sigma, St Louis, MO); </li><li> Kalsiyum göstergesi Rhod 02:00 (Invitrogen, Carlsbad, CA) stok solüsyonu, DMSO içinde 1 mg / ml. </li></ol></li><li> Önceden eksitasyon-kasılma uncoupler blebbistatin stok solüsyonu hazırlayın (Bioscience Tocris, St Louis, MO, DMSO içinde 2 mg / ml) ve 4 çözünmüş blebbistatin saklamak ° C </li></ol> 2. Perfüzyon çözümleri ve deney düzeneği 7 hazırlayın <ol start="4"><li> Taze 2L Tyrode çözüm hazırlamak (128.2mM NaCl, 1.3mm CaCl 2 (2H 2 O), 4.7mM KCl, 1.05mM MgCl 2 (6H 2 O), 1.19mM NaH 2 PO 4, 20mm NaHCO 3 11.1mM D-glikoz deiyonize su, pH = 7.35 ± 0.05). Stok solüsyonu Tyrode çözümü Stok I Stok II, 125 ml, 125 ml (bir deney için yeterli) 1750 mL deiyonize su eklenir ve karıştırılır ve glikoz 4g 2L yapmak için kullanılan ediliyor. </li><li> Perfüzyon sistemleri iki pompa açın. 40 ml / dak retrograd perfüzyon için kullanılan peristaltik pompa (Peri-Star, TEFE, Sarasota, Amerika Birleşik Devletleri) ayarlayın. Superfusion için kullanılan diğer bir peristaltik pompa (Cole-Parmer Masterflex Peristalic Pompa L / S, Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, Illinois) ayarlayın ve holding rezervuar 80 ml / dk 'ya perfüzat geri dönmek için. </li><li> Perfüzyon sistemi 2L deiyonize su ile, sonra 30 dakika ve% 70 etanol ile yıkayın. </li><li> Tyrode çözümü tüm deiyonize su sirkülasyonunu ve 5 mikron filtre (Millipore, Billerica, MA, ABD) üzerinden geçmek, oda tahliye. +37 Için perfüzat Sıcak ° C O 2 / CO 2 (% 95 /% 5) gaz köpüren bir çözüm içine bir su ceketi ve sirkülatör (ThermoNESLAB EX7, Newtown, ABD) ve oksijen perfüzat. PH metre (Oakton Instruments, Vernon Hills, IL) ile çözeltinin pH Monitör ve 7.35 ± 0,05 pH tutmak için O 2 / CO 2 köpüren hızını ayarlayabilirsiniz. Deney sırasında izleme pH ve sıcaklık devam edin. </li><li> Çift optik eşleme cihaz yüksek uzaysal (100x100 piksel, 230 ± piksel başına 20 mikron) ve temporal (1,000-3,000 kare / sn) çözünürlük iki MICAM Ultima-L CMOS kameralar (SciMedia, Costa Mesa, CA) oluşur. Fix kalsiyum görüntüleme kameranın önünde bir band geçiren filtre (590 ± 15 nm, Thorlabs, Newton, NJ); süre, uzun bir-pass filtre (&gt; 700 nm, Thorlabs, Newton, NJ) yerleştirilmiş olması gerekir belirlenen gerilim görüntüleme kamera önünde. Kameralar dikroik ayna (635 nm kesme, Omega Optik, Brattleboro, VT) içeren bir tutucu, birbirlerine dik olarak düzenlenir. Çift kamera sahibi hemen altında kalp dikroik ayna üzerine gelen emisyon ışığı odaklanan bir lens (Nikon Nikkor 55 mm 1:1.4 235.052), yoktur. Çalışma mesafesi yaklaşık 3cm. Uyarma ışık, bir halojen lamba (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) tarafından oluşturulan ve ısı filtre, obtüratör ve bant geçiren filtre (520 ± 45 nm) geçirilir. Esnek bir ışık kılavuzu hazırlanması üzerine bant geçiren filtre ışık yönlendirir ve bir deklanşör hazırlık boyaların photobleaching önlemek için sadece görüntü alımı sırasında ışığa maruz olduğunu sağlamak için kullanılır. </li><li> Pacing ve algılama için önceden hazırlayın ve Ag / AgCl 2 elektrot odasında kalp yerleştirmeden önce bunları yükleyin. Amplifikatörler ve filtreler uygun seviyelere ayarlanmış olduğundan emin olun. </li></ol> 3. , Fare kalp Hasat cannulate ve Langendorff perfüzyon kurdu <ol start="10"><li> Ve intraperitoneal heparin (100 adet), ketamin / xylazine (ksilizin, 10 mg / kg ketamin, 80mg/kg vücut ağırlığı) ile fare anestezisi. Ağrı refleksi eksikliği ile uygun bir anestezi düzeyi sağlayın. </li><li> Orta sternal insizyon sonra, hızlı kalp kaldırmak ve (% 95 O 2,% 5 CO 2) oksijenli yıkayın, sabit sıcaklığı (37 ± 1 ° C) Tyrode çözümü. </li><li> Diseksiyon mikroskop kullanarakAort hızla belirlemek ve sağ subklavian arter altında çıkan aortun boyunca temiz bir kesim yapmak. Aort kısa bir bölümü daha sonra özel bir bağlı alevlendi bir ucu ile 21 gauge kanül yaptı. 4-0 siyah örgülü ipek sütür (Cerrahi Uzmanlıkları Corporation, Reading, PA) kanül üzerine kalbi düzeltmek için kullanılır. Kanülasyon sonra, kalp retrograd perfüze ve Tyrode çözümü ile superfused. Bridge Amplifikatör TBM4M, TEFE, Sarasota, retrograd perfüzyon oranı aort basıncı 60 ile 80 mmHg (Basınç detektörler, Dünya hassas aletler Inc (TEFE), Sarasota, Amerika Birleşik Devletleri tutmak için 2-5 ml / dak aralığında ayarlanır. ABD). </li><li> Sonra kalp kanüle, akciğer, timus ve yağ dokusu disseke ve kaldırılır. </li><li> Izole kalp akışı bağlı hareket etmesini önlemek için perfüzyon odasının alt apeks (Sylgard kaplamalı) (Güzel Bilim Araçları) tutturulmuş. Sağ ve sol atriyal uzantıları da gergin ve kulakçıklar optik ölçümler için maksimum yüzey alanı sağlar odası, alt (Güzel Bilim Araçlar, Inc, Foster City, CA) tutturulmuş. Çok önemli! Küçük bir silikon tüp pulmoner venler ile sol ventrikül içine yerleştirilir ve yakındaki bağ dokusu ipek sütür ile sabittir. Bu çözüm tıkanıklık ve bir eksitasyon-kasılma uncoupler ile ventriküler kasılmaları bastırılması sonra özellikle önemlidir (bkz. Bölüm 4 adımda 19) sol ventrikül, sıkışıp perfüzat asitlenme önler. </li><li> Master-8 (AMP Instruments Ltd, Kudüs, İsrail) veya PowerLab 26T (AD Instruments, Sidney, Avustralya) tarafından oluşturulan pacing uyarılara yapmak için yapılmış özel bir elektrod kalbin yüzeyine yerleştirilir. </li><li> Küçük bir kapak cam, titreşimli bir çözüm hareket artifakı azaltmak için kalp üzerinde çözüm yüzey üzerine monte edilmiştir. </li><li> Odak kalp ikaz ışığı. Buna ek olarak, çift kamera aparatı ve maksimum çözünürlük elde edilecek, böylece kalp arasındaki mesafeyi ayarlamak. </li><li> Odadaki tüm ışıkları kapatın ve elektrik kayıtları PowerLab 26T kullanarak başlamak. </li></ol> 4. Yük gerilimi ve kalsiyum duyarlı boyalar ve eksitasyon-kasılma uncoupler <ol start="19"><li> Warm-up blebbistatin 0.6 ml. 0.5 mL holding rezervuar perfüzat blebbistatin karıştırın. Tyrode çözümü 1 mL blebbistatin kalan 0.1 mL seyreltilir ve kanül yakınında bulunan bir ilaç bağlantı noktası üzerinden yavaş yavaş (bir 20 dakikalık süre içinde) enjekte. Blebbistatin yavaş yavaş hareket artifakı azaltır gözlemleyin. </li><li> 1 ml Tyrode çözümü voltaj duyarlı boya RH237 stok solüsyonu 30 mcL sulandırınız ve yavaş yavaş blebbistatin aynı enjeksiyon portuna 5-7 dakika içinde enjekte. </li><li> 30 mcL kalsiyum göstergesi Rhod-02:00 1 ml Tyrode çözümü seyreltilir ve 5-10 dakika boyunca yavaş yavaş aynı enjeksiyon portu yoluyla uygulanan Pluronic F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, DMSO% 20 çözüm) ile karıştırılır ve 1:1 . </li><li> Blebbistatin ve hücre zarı ve sitoplazmada ulaşmak için boyalar için 5-10 dakika bekleyin. Hareket tamamen bastırıldı protokol ile devam edin. </li><li> Sürekli bütün prosedür üzerinden monitörü EKG kayıtları, kalbin normal elektrik fonksiyonunu sağlamak. </li><li> SciMedia özel yazılım (SciMedia, Costa Mesa, CA) kullanılarak floresan sinyal kayıtları başlar. </li></ol> 5. Temsilcisi sonuçları: <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 perfüzyon, elektrik kayıtları ve optik haritalama için deneysel kurulum. EM = emisyon; Lp = longpass <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 ventriküler pacing sırasında kaydedilen Deneysel hazırlama ve sinyal örnekleri. Sol: EKG sinyalleri 2 Ag / AgCl disk elektrotlar (En İyi) ve S1S1 stimülasyon protokolü bir örnek gösterilmiştir (Alt) toplanan. Merkezi: Langendorff fare kalp hazırlanması. Sağ: optik Temsilcisi aksiyon potansiyelleri ve kulakçıklar (Üst) ve ventriküllerin (Alt) kalsiyum geçici sinyalleri gösterilmiştir. Sarı ok (Üst), atriyal kayıtlarında görülmektedir ventriküller, gelen floresan sinyal saçılma noktaları. AG = sol ventrikül; RV = sağ ventrikül, LA = sol atriyum; RA = sağ atrium <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 V m ve vahşi bir tür fare kalp ventriküller Cat Temsilcisi optik kayıtlar. A. optik kayıtları (C) görülebilmektedir siyah noktalar işaretlenmiş eşit aralıklı yerlerden bir dizi deney hazırlık. B. Örnek dizi merkezi bir konuma V m ve CAT (bkz. kutu izleme In (C)). C. V, eşit aralıklı yerlerden dizi m (mavi) ve CAT (kırmızı) . Sinyaller 3x3 binned edildi. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 Etkinleştirme harita ve iletim. A. enine (T) ve beyaz oklarla gösterilen boyuna (L) yönden vahşi bir tür fare kalp bir örnek aktivasyon haritası. B. V m sinyalleri (Üst) ve görülen üç puan dV / dt (Alt) karşılık gelen (T1, T2, T3, L1, L2, L3). <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 Aksiyon potansiyeli ve kalsiyum geçici süre analizi. % 80% 80 gevşeme (CaD80) repolarizasyon (APD80) ve kalsiyum geçici süresi A. Aksiyon potansiyeli süresi haritalar kontrol koşulları altında bir kalp (Sol) ve 30 nM isoproterenol uygulama (Sağ) sonra gösterilmiştir. Ventriküller yeşil / sarı renk (Sağ) kısaltılmış isoproterenol APD80 ve CaD80 gösterir. Vahşi tip fare ventriküllerin (Üst) ve kulakçıklar (Alt) APD80 ve CaD80 B. Örnek iz.

<ol><li>Efimov, I. R., Rendt, J. M., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+maps+of+intracellular+%5BCa2%2B%5Di+transients+and+action-potentials+from+the+surface+of+perfused+guinea-pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts.</a> Circulation. 90, 1-1 (1994).</li>
<li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+repolarization+and+refractoriness+from+intact+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of repolarization and refractoriness from intact hearts.</a> Circulation. 90, 1469-1480 (1994).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> J Physiol. 529, 171-188 (2000).</li>
<li>Pruvot, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+calcium+cycling+versus+restitution+in+the+mechanism+of+repolarization+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Role of calcium cycling versus restitution in the mechanism of repolarization alternans.</a> Circ Res. 94, 1083-1090 (2004).</li>
<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95, 21-33 (2004).</li>
<li>Fast, V. G. Recording action potential using voltage sensitive dyes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFast%2C+VG+%22Practical+methods+in+cardiovascular+research%22">Practical methods in cardiovascular research</a>. Dhein, S., Delmoar, M. , Springer. New York. 233-255 (2005).</li>
<li>Glukhov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+K%28ATP%29+channel+pharmacology+in+intact+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. , (2009).</li>
<li>Baker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dispersion+of+repolarization+and+refractoriness+in+transgenic+mouse+hearts+promotes+reentrant+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced dispersion of repolarization and refractoriness in transgenic mouse hearts promotes reentrant ventricular tachycardia.</a> Circ Res. 86, 396-407 (2000).</li>
<li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacol Res. 41, 613-627 (2000).</li>
<li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+electrode+polarization+in+the+far+field%3A+implications+for+external+defibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Virtual electrode polarization in the far field: implications for external defibrillation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279, 1055-1070 (2000).</li>
<li>Hammouda, M., Kinosita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coronary+circulation+in+the+isolated+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The coronary circulation in the isolated heart.</a> J Physiol. 61, 615-628 (1926).</li>
<li>Salama, G., Hwang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+optical+mapping+of+intracellular+free+calcium+and+action+potentials+from+Langendorff+perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts.</a> Curr Protoc Cytom. 12, 17-17 (2009).</li>
<li>Lou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+panoramic+imaging+of+epicardial+electrical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Quantitative panoramic imaging of epicardial electrical activity.</a> Ann Biomed Eng. 36, 1649-1658 (2008).</li>
<li>Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+new%2C+long-wavelength%2C+voltage-sensitive+dyes+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart.</a> J Membr Biol. 208, 125-140 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu deneyde bir eksitasyon-kasılma uncoupler ile ventriküler kontraksiyonlar bastırılması sonra çok önemli olan küçük bir silikon tüp ekleyerek Langendorff perfüzyon yöntemi değiştirilebilir. Silikon tüp çözüm tıkanıklığı, perfüzyon çözüm asitlenme, ve sol ventrikül iskemi gelişimini önlemek için kullanılır. Fare kalp hipotermi çok duyarlı, bu nedenle, kalp boyunca sıcaklık değişimleri aksiyon potansiyeli süresi suni farklılıklar neden olacaktır. Sonuç olarak, ısıtma sistemi, deney 8 tamamının sırasında 37 ° C sabit sıcaklıkta korumak için perfüzyon odasında hayata geçirildi . Langendorff modeli kalp innervasyon korumak olmadığından, fizyolojik, sempatik ve parasempatik 9 araştırmak için perfüzat nörotransmitterlerin ekleyerek dikkate almak gerekiyor . Retrograd perfüzyon yanı sıra, kalp superfusion ek, pH ve sıcaklık gibi uygun çevresel parametrelerin korumaya yardımcı olur. Bu yöntemde, Langendorff perfüze kalp yatay olarak yerleştirilmiştir. Dikey Langendorff perfüzyon kurulum 10 de kullanılıyor olabilir, ancak biraz daha farklı bir kardiyak mekaniği 11 neden olabilir. CMOS kameraların yanı sıra, alternatif dedektörler de mevcuttur ve haritası V m ve aynı anda CAT 12 uygulanabilir. Uygulama yüksek ayıklanmasıdır çözünürlüklü CMOS kameraların kayıtları doğruluğu garanti eder; ancak, optik haritalama sinyalleri tek bir hücre değildir. Aksine, her floresan sinyal optik büyütme bağlı olarak, yüzlerce ya da binlerce hücre geliyor. Çok daha büyük bir ventrikül floresan optik saçılma atriyal sinyallerini bozabilir, bu nedenle optik kaydedilen sinyalleri dikkatli yorumlanması gereklidir. Fare preparat başka bir sınırlama kalp 13 küçük boyutu nedeniyle yüzey eğriliği ile indüklenen sinyal bozulma ve gürültü. Iletim hızı ölçümleri sadece fare kalp eğriliği değil, aynı zamanda elektrot polarite ve sanal elektrotlar değişmiş olabilir. Iletim hızı, aktivasyon anizotropi ve repolarizasyon haritalar doğruluk elde etmek için, kalp yüzeyinde kamera odaklama düzeltmek şarttır. Bu yöntemde, gerçek zamanlı EKG kayıtları, kardiyak elektrofizyoloji optik soruşturma tamamlayabilir. Gerilim duyarlı boya (RH237) ve kalsiyum göstergesi (Rhod 02:00) hızlı yanıt nedeniyle protokol, benzer uyarma, ve farklı emisyon spektrumları 3,7 kullanılır. V m ve CAT RH237 dışında ve Rhod-02:00 3 ölçmek için kullanılan boyalar alternatif kombinasyonları vardır. Büyük bir Stoke vardiya (&gt; 200 nm) ile bir gerilim romanı duyarlı boya, PGHI, çünkü PGHI ve Rhod-02:00 14 arasında emisyon dalga boylarında büyük bir ayrılık daha iyi V m ve CAT sinyalleri izin bulundu. Gelecek gelişmeler yeni flüoresan millerini, yeni görüntüleme dedektörleri gelişimi, ve geliştirilmiş görüntü işleme yazılımı üzerine odaklanabilir. Yüksek çözünürlük ve 3 boyutlu optik haritalama için yeni optik görüntüleme yöntemleri de optik haritalama 5 gelecekte önemli yön vardır .

<table border="1"><tbody><tr><td> Kimyasal </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S271-1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 (2H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> C79-500 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S217-500 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (6H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 (H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S369-500 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S233-3 </td></tr><tr><td> D-glikoz </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> D16-1 </td></tr><tr><td> Blebbistatin </td><td> Bioscience Tocris Ellisville, MO </td><td> 1760 </td></tr><tr><td> RH237 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> S1109 </td></tr><tr><td> Rhod-02:00 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> R1244 </td></tr><tr><td> Pluronic F127 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> P3000MP </td></tr><tr><td> Dimetil sulphoxide (DMSO) </td><td> Sigma, St Louis, MO </td><td> D2650 </td></tr></tbody></table>

fare kalp aksiyon potansiyelleri ve kalsiyum geçici optik haritalama

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Fare kalbi, bu türün genetik mühendisliği için düşük maliyetli teknoloji varlığı nedeniyle kardiyovasküler çalışmalar için popüler bir model. Fare kalp Kardiyovasküler fizyolojik fenotipleme transmembran potansiyeli için çeşitli sondalar (V m), kalsiyum transientler (CAT) ve diğer parametreler istihdam floresan görüntüleme kullanarak kolayca yapılabilir. Tahrik olma-daralma kaplin, aksiyon potansiyeli ve hücre içi kalsiyum dinamikleri ile karakterize edilir; bu nedenle, kalp 1-4 aynı yerden aynı anda V m ve kedi Her iki harita derece önemli. Langendorff eş zamanlı optik haritalama perfüze fare kalpleri, kalp yetmezliği, aritmiler, metabolik hastalık ve diğer kalp hastalıklarının altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için bir potansiyele sahiptir. Aktivasyon Görselleştirme, iletim hızı, aksiyon potansiyeli süresi ve sitelerin sayısız diğer parametreler hücresel düzeyde soruşturma elde edemez ama iyi optik haritalama 1,5,6 tarafından çözüldü. Bu yazıda, state-of-the-art CMOS görüntüleme teknolojisi kullanarak yüksek alansal ve zamansal çözünürlüğe sahip fare kalplerinde V m ve kedi aynı anda optik haritalama için enstrümantasyon kurulum ve deneysel koşullar mevcut Bu yöntem ile elde edilen tutarlı optik kayıtları Langendorff perfüze fare kalpleri eşzamanlı optik haritalama uygulanabilir ve güvenilir hem de göstermektedir.

Bu kağıt sağlam izole Langendorff transmembran potansiyeli (Vm) ve geçici hücre içi kalsiyum (CAT) optik haritalama sırasında diseksiyon prosedürü, enstrümantal kurulum ve deneysel koşullar fare kalpleri perfüze.

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

Fare kalbi, bu türde genetik mühendisliği için düşük maliyetli teknolojilerin mevcut olması nedeniyle kardiyovasküler çalışmalar için popüler bir modeldir. ...

Bu prosedürün genel amacı, izole edilmiş, LOR perfüze edilmiş tam fare kalplerinde transmembran potansiyeli ve hücre içi kalsiyum geçişini aynı anda optik olarak haritalandırmaktır. Bu işlem, öncelikle tam fare kalbinin çıkarılması, ardından aortanın kanüle edilmesi ve LOR perfüzyonuna başlanmasıyla gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, bir eksitasyon kontraksiyon kuplörü yükleyerek kalbi hareketsiz hale getirmek ve ardından kalbi perfüzyon haznesine sabitlemektir.Son adımlar, optik boyaların yüklenmesi ve deney sırasında hareket artefaktlarını azaltmak için hazırlıkların yapılmasıdır. Optik görüntüler, kalpten yayılan ışığın my cam Ultima LC Moss kameralar ile toplanmasıyla elde edilir. Hey, benim adım di.Washington Üniversitesi'nde lisansüstü öğrencisiyim. Bu tekniğin mikro elektrot gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, optik haritalamanın kalbin tüm yüzeyi boyunca daha yüksek uzamsal çözünürlük sağlamasıdır. Merhaba, ben Matt Sulkin.Washington Üniversitesi'nde lisansüstü öğrencisiyim. Bu yöntem, doğru uygulandığında, aritmogenezin temeli gibi kardiyak elektrofizyolojideki birçok sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Çözeltileri dakikada 40 mililitre hızda sirküle etmek için bir peristaltik pompayı konfigüre ederek başlayın.Ardından, ikinci bir peristaltik pompayı dakikada 80 mililitreye ayarlayın. Bu pompa, Perfuse sekiz'i tutma ve oksijenlendirme rezervuarına geri gönderir. Pompaları çalıştırın ve sistemi bir litre %70 etanol ile 30 dakika boyunca resirkülasyonla yıkayın.Bu yıkama işlemini, resirkülasyon yapmadan iki litre deiyonize su ile takip edin. Su tahliye edildiğinde, iki litre Tyro solüsyonunu sirküle edin ve beş mikronluk bir filtreden geçirin. Perfüzyon sistemini bir su ceketi ve sirkülatör ile 37 °C'ye ısıtın ve solüsyonun içine oksijenle zenginleştirilmiş gaz kabarcıkları verin.pH değerini 7,35 ± 0,05 seviyesinde tutmak için gaz kabarcıklanma hızını ayarlayın. Deney boyunca hem pH'ı hem de sıcaklığı takip edin. Çift optik haritalama düzeneği, saniyede 3000 kare hızında 100 x 100 piksellik bir görüntü yakalayabilen iki adet yüksek hızlı CMOS kameradan oluşmaktadır.Çiftli kamera tutucuya, kalsiyum görüntüleme kamerasına bir bant geçiren filtre ve voltaj görüntüleme kamerasına bir uzun geçiren filtre takın. Kalpten gelen emisyon ışığının lens tarafından aynaya odaklanmasını sağlayacak şekilde bir dikiz aynası ve lens takın. Ayrıca, tutucuya iki kamera takın ve bunları birbirine dik olacak şekilde düzenleyin.Ardından, eksitasyon ışığını ayarlayın. Işık, bir halojen lamba tarafından üretilir ve esnek bir ışık kılavuzu aracılığıyla yönlendirilir. Işığı bir ısı filtresinden, maruziyeti sınırlamak için bir deklanşörden ve bir eksitasyon bant geçiren filtreden geçirin.Son olarak, gümüş ve gümüş klorür elektrotlarını hazneye yerleştirerek hazırlayın. Amplifikatör ve filtrelerdeki seviyeler iki kez kontrol edilip ayarlandıktan sonra kurulum bir kalp için hazır hale gelir. İşleme geçmeden önce, bir fareyi anestezi altına almak için 100 ünite heparin içeren ketamin ve ksilazin kokteyli kullanın.Ayak parmağı sıkıştırma yöntemiyle hayvanın ağrı refleksinin olmadığını doğrulayın. Sternumun ortasından bir insizyon yaptıktan sonra, kalbi ve çevre dokuları hızla çıkarın. Ardından, bir diseksiyon mikroskobu kullanarak aortu hızla tanımlayın ve sağ subklavian arterin altındaki çıkan aort boyunca temiz bir kesi yapın.Şimdi, aorta'nın kısa bir bölümünü dört adet siyah örgü ipek sütür kullanarak özel yapım 21 gauge bir kanüle bağlayın. Kanülasyondan sonra kalbi Tyrode çözeltisi ile retrograd olarak perfüze edin ve süperfüze edin. Bir basınç transduseri ile ölçüldüğünde, aortik basıncı 60 ile 80 mmHg arasında tutacak şekilde akış hızını ayarlayın.Şimdi çevreleyen akciğer timusunu ve yağ dokusunu diseke ederek çıkarın. Ardından, pulmoner venler aracılığıyla sol ventriküle bir silikon tüp yerleştirin. Tüpü yakındaki bağ dokusuna dikerek sabitleyin.Bu oldukça önemli adım, özellikle ventriküler kasılmaların baskılanmasından sonra, sol ventrikülde hapsolan Perfuse eight'in neden olduğu tıkanıklığı ve asidifikasyonu önler. Perfuse eight kaynaklı kalp hareketlerini önlemek için kalbi, apeksinden, sill guard kaplamalı perfüzyon odasının tabanına iğneleyin. Ayrıca, atriyumların dik konumdaki yüzey alanını artırmak için sağ ve sol atriyal apendiksleri gererek iğneyle sabitleyin.Bu işlem, kayıt yüzey alanını maksimize edecektir. Pacing stimülasyonlarını gerçekleştirmek için kalbin yüzeyine özel yapım bir elektrot yerleştirin. Hareket artefaktlarını azaltmak için kalbin üzerine, solüsyon yüzeyinde küçük bir lamel sabitleyin.Bunu, camı birkaç pin arasına sıkıştırarak yapın. Son hazırlıklar olarak, uyarım ışığını kalbe odaklayın ve optik bir görüntü elde etmek için kameraları konumlandırın, ardından boyaları yüklerken boya yükleme işlemine başlayın. Kalbin normal elektriksel fonksiyonunu sağlamak için EKG kayıtlarını sürekli izleyin.BLEs statini oda sıcaklığına getirerek başlayın. Ardından, yarım mililitre BLEs statini tutma rezervuarındaki profuse eight ile karıştırın ve kalan 0,1 mililitre BLEs statini bir mililitre Tyros çözeltisi içinde seyreltin. Sonraki 20 dakika boyunca, tyros içindeki BLEs statini kanül yakınındaki bir ilaç portundan yavaşça enjekte edin.BLE statin, hareket artefaktını kademeli olarak azaltacaktır. Ardından, 30 µL voltaja duyarlı boyayı bir mL tyro çözeltisi ile seyreltin ve bu karışımı beş ila yedi dakika boyunca yavaşça aynı ilaç portuna enjekte edin. Daha sonra aynı karışımı tekrar hazırlayın.Bu aşamada, 30 µL ek kalsiyum indikatörü ekleyin. Bu karışımı aynı port üzerinden beş ila 10 dakika boyunca yavaşça uygulayın. Kalsiyum indikatörü enjekte edildikten sonra, deneye devam etmeden önce BLE'lerin statinle hareketi tamamen baskılaması ve boyaların hücrelere girmesi için beş ila 10 dakika daha bekleyin.Bu kalp preparatı hazırlandı. Protokole uygun olarak, S1-S1 stimülasyonu ile ventriküler pacing sırasında EKG sinyalleri kaydedildi. Aksiyon potansiyelleri ve kalsiyum geçici sinyalleri soldaki atriyumlardan ve sağdaki ventriküllerden kaydedildi.Ok, kamera kayıtlarının üç piksel çarpı üç piksellik birimler halinde gruplandırılmasıyla ventriküllerden gelen sinyal saçılımının gerçekleştiği yeri göstermektedir; böylece dizi verilerinden kalsiyum geçişleri ve aksiyon potansiyellerinden oluşan bir dizi görüntülenebilir. Aksiyon potansiyeli iletimini gösteren bir figür oluşturulabilir. Transvers ve longitudinal eksen üzerindeki birbirini takip eden üç noktadan elde edilen veriler, aksiyon potansiyelinin bir ventrikül yüzeyi boyunca yayılmasıyla birlikte meydana gelen genlik değişimini göstermektedir.Benzer şekilde, aksiyon potansiyeli ve kalsiyum geçici süresini gösteren bir şekil oluşturulabilir. Bu şeklin solunda kontrol durumu, sağında ise deney durumu yer almaktadır. Kalbe yapılan isoproterenol enjeksiyonu, hem kalsiyum geçici sürelerini hem de aksiyon potansiyeli sürelerini belirgin şekilde kısaltmaktadır.Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, bu prosedür takip edilerek iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. AV düğümünün refrakter dönemi ile ilgili olanlar gibi ek soruları yanıtlamak için pacing protokolü gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

optical-mapping-action-potentials-calcium-transients-mouse

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu makale, potansiyometrik boya kullanarak (di-8-ANEPPS) Langendorff perfüze sıçan kalpleri yüzeyinde optik görüntü aksiyon potansiyeli hareketi yüksek bir zamansal ve mekansal çözünürlükte tekniği açıklar.

Langendorff perfüze sıçan Kalpler Optik Haritalama

Bu makale, panoramik görüntüleme sistemi kullanılarak Langendorff perfüze tavşan kalbinde, optik haritalama deneylerini için temel prosedürleri ve ikili (voltaj ve kalsiyum) görüntüleme yöntemidir.

Çok parametreli Langendorff perfüze Tavşan Kalp Optik Haritalama

Bu makale, kültürlenmiş HL-1 atriyal hücre tek katmanlarında çift kanallı optik haritalama gerçekleştirmek için kullanılan tekniği açıklamaktadır. Bu benzersiz protokol, kültür tek katmanlarının elektrofizyolojik özelliklerinin ayrıntılı tespiti ve analizi için aynı alanda hem kalsiyum (Ca) hem de voltaj (Vm) aktivitesinin aynı anda görselleştirilmesine olanak tanır.

Kültürlü HL-1 Atriyal miyositlerdeki Monolayer Gerilim ve Kalsiyum Çift Kanal Optik Haritalama

Bu makalede, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde ayrıntılı protokol ve transmembran potansiyeli (V m) ikili optik haritalama ve ücretsiz içi sarkoplazmik retikulum (SR) için gerekli donanımın Ca 2+ açıklanır. Bu yöntem, sağlam kalbinde, doğrudan gözlem ve V m ölçümü ve SR Ca 2 + dinamikleri sağlar.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Burada, bir yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte, farenin sağ atrium ve özellikle Çin-atriyal düğümden elektriksel aktivitenin optik haritalama için bir protokol mevcut.

Fare Çin-atriyal düğüm yüksek çözünürlüklü optik Haritalama

Bu iletişim kuralı ile yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüklü, membran gerilim çift kayıtları da dahil olmak üzere bir optik haritalama sistemi kullanan fare Kulakçık Elektrofizyolojik değerlendirme açıklar ve Ca2 + geçici altında programlanmış stimülasyon özel elektrot kateter aracılığıyla.

Yüksek çözünürlüklü optik eşleştirmenin fare Atria Elektrofizyolojik değerlendirme

Murine miyositlerin izolasyonu ve aynı anda gerilim veya kalsiyum izlerinin nasıl elde edilecegini, eşzamanlı dijital hücre geometrisi ölçümleri ile floresan fotometri kullanarak sarcomere kısaltma izleriyle birlikte saglamak için metodolojiyi savuruyoruz.

İzole Murine Ventriküler Miyositlerin Optik Görüntülemesi

Bu çalışmanın amacı, kardiyak dinamiği n çevirisel bir hayvan modeli kullanarak araştırmak için bir yöntem oluşturmaktır. Açıklanan deneysel yaklaşım, izole, bozulmamış bir domuz kalp modelindeki elektriksel aktiviteyi değerlendirmek için elektrofizyolojik bir çalışma ile birlikte çift emisyonlu optokardiografi içerir.

Ex Vivo Langendorff perfüzyonlu Kalplerin Optokardiyografi ve Elektrofizyoloji Çalışmaları

Bu protokol, preklinik ilaç testi için insan kardiyak dilimlerinin kesilmesi ve kültüre edilmesi prosedürünü açıklar ve bu dilimlerden aynı anda transmembran voltajı ve hücre içi kalsiyum sinyallerini kaydetmek için optik haritalamanın kullanımını ayrıntılarıyla açıklar.

İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

Bu protokol, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip transmembran voltajının ve hücre içi Ca2+ geçici akımlarının elektrofizyolojik ölçümleri de dahil olmak üzere, katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardiden etkilenen vahşi tip ve knock-in hayvanlardan elde edilen fare kalplerinin çift boyutlu optik haritalamasını sunar.

Katekolaminerjik Polimorfik Ventriküler Taşikardi RyR2R2474S Knock-In Farelerinden Kalplerin Çift Boyutlu Optik Haritalaması

Öğrenin fare kalbinde optik haritalama yöntemiyle aksiyon potansiyelleri ve kalsiyum geçişlerini eşzamanlı olarak nasıl kaydedebilirsiniz. Bu teknik aritmi araştırmalarında yüksek uzamsal çözünürlük sağlar.

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

Daha fazla video keşfet