Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

Bu prosedürün genel amacı, izole edilmiş, LOR perfüze edilmiş tam fare kalplerinde transmembran potansiyeli ve hücre içi kalsiyum geçişini aynı anda optik olarak haritalandırmaktır. Bu işlem, öncelikle tam fare kalbinin çıkarılması, ardından aortanın kanüle edilmesi ve LOR perfüzyonuna başlanmasıyla gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, bir eksitasyon kontraksiyon kuplörü yükleyerek kalbi hareketsiz hale getirmek ve ardından kalbi perfüzyon haznesine sabitlemektir.

Son adımlar, optik boyaların yüklenmesi ve deney sırasında hareket artefaktlarını azaltmak için hazırlıkların yapılmasıdır. Optik görüntüler, kalpten yayılan ışığın my cam Ultima LC Moss kameralar ile toplanmasıyla elde edilir. Hey, benim adım di.

Washington Üniversitesi'nde lisansüstü öğrencisiyim. Bu tekniğin mikro elektrot gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, optik haritalamanın kalbin tüm yüzeyi boyunca daha yüksek uzamsal çözünürlük sağlamasıdır. Merhaba, ben Matt Sulkin.

Washington Üniversitesi'nde lisansüstü öğrencisiyim. Bu yöntem, doğru uygulandığında, aritmogenezin temeli gibi kardiyak elektrofizyolojideki birçok sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Çözeltileri dakikada 40 mililitre hızda sirküle etmek için bir peristaltik pompayı konfigüre ederek başlayın.

Ardından, ikinci bir peristaltik pompayı dakikada 80 mililitreye ayarlayın. Bu pompa, Perfuse sekiz'i tutma ve oksijenlendirme rezervuarına geri gönderir. Pompaları çalıştırın ve sistemi bir litre %70 etanol ile 30 dakika boyunca resirkülasyonla yıkayın.

Bu yıkama işlemini, resirkülasyon yapmadan iki litre deiyonize su ile takip edin. Su tahliye edildiğinde, iki litre Tyro solüsyonunu sirküle edin ve beş mikronluk bir filtreden geçirin. Perfüzyon sistemini bir su ceketi ve sirkülatör ile 37 °C'ye ısıtın ve solüsyonun içine oksijenle zenginleştirilmiş gaz kabarcıkları verin.

pH değerini 7,35 ± 0,05 seviyesinde tutmak için gaz kabarcıklanma hızını ayarlayın. Deney boyunca hem pH'ı hem de sıcaklığı takip edin. Çift optik haritalama düzeneği, saniyede 3000 kare hızında 100 x 100 piksellik bir görüntü yakalayabilen iki adet yüksek hızlı CMOS kameradan oluşmaktadır.

Çiftli kamera tutucuya, kalsiyum görüntüleme kamerasına bir bant geçiren filtre ve voltaj görüntüleme kamerasına bir uzun geçiren filtre takın. Kalpten gelen emisyon ışığının lens tarafından aynaya odaklanmasını sağlayacak şekilde bir dikiz aynası ve lens takın. Ayrıca, tutucuya iki kamera takın ve bunları birbirine dik olacak şekilde düzenleyin.

Ardından, eksitasyon ışığını ayarlayın. Işık, bir halojen lamba tarafından üretilir ve esnek bir ışık kılavuzu aracılığıyla yönlendirilir. Işığı bir ısı filtresinden, maruziyeti sınırlamak için bir deklanşörden ve bir eksitasyon bant geçiren filtreden geçirin.

Son olarak, gümüş ve gümüş klorür elektrotlarını hazneye yerleştirerek hazırlayın. Amplifikatör ve filtrelerdeki seviyeler iki kez kontrol edilip ayarlandıktan sonra kurulum bir kalp için hazır hale gelir. İşleme geçmeden önce, bir fareyi anestezi altına almak için 100 ünite heparin içeren ketamin ve ksilazin kokteyli kullanın.

Ayak parmağı sıkıştırma yöntemiyle hayvanın ağrı refleksinin olmadığını doğrulayın. Sternumun ortasından bir insizyon yaptıktan sonra, kalbi ve çevre dokuları hızla çıkarın. Ardından, bir diseksiyon mikroskobu kullanarak aortu hızla tanımlayın ve sağ subklavian arterin altındaki çıkan aort boyunca temiz bir kesi yapın.

Şimdi, aorta'nın kısa bir bölümünü dört adet siyah örgü ipek sütür kullanarak özel yapım 21 gauge bir kanüle bağlayın. Kanülasyondan sonra kalbi Tyrode çözeltisi ile retrograd olarak perfüze edin ve süperfüze edin. Bir basınç transduseri ile ölçüldüğünde, aortik basıncı 60 ile 80 mmHg arasında tutacak şekilde akış hızını ayarlayın.

Şimdi çevreleyen akciğer timusunu ve yağ dokusunu diseke ederek çıkarın. Ardından, pulmoner venler aracılığıyla sol ventriküle bir silikon tüp yerleştirin. Tüpü yakındaki bağ dokusuna dikerek sabitleyin.

Bu oldukça önemli adım, özellikle ventriküler kasılmaların baskılanmasından sonra, sol ventrikülde hapsolan Perfuse eight'in neden olduğu tıkanıklığı ve asidifikasyonu önler. Perfuse eight kaynaklı kalp hareketlerini önlemek için kalbi, apeksinden, sill guard kaplamalı perfüzyon odasının tabanına iğneleyin. Ayrıca, atriyumların dik konumdaki yüzey alanını artırmak için sağ ve sol atriyal apendiksleri gererek iğneyle sabitleyin.

Bu işlem, kayıt yüzey alanını maksimize edecektir. Pacing stimülasyonlarını gerçekleştirmek için kalbin yüzeyine özel yapım bir elektrot yerleştirin. Hareket artefaktlarını azaltmak için kalbin üzerine, solüsyon yüzeyinde küçük bir lamel sabitleyin.

Bunu, camı birkaç pin arasına sıkıştırarak yapın. Son hazırlıklar olarak, uyarım ışığını kalbe odaklayın ve optik bir görüntü elde etmek için kameraları konumlandırın, ardından boyaları yüklerken boya yükleme işlemine başlayın. Kalbin normal elektriksel fonksiyonunu sağlamak için EKG kayıtlarını sürekli izleyin.

BLEs statini oda sıcaklığına getirerek başlayın. Ardından, yarım mililitre BLEs statini tutma rezervuarındaki profuse eight ile karıştırın ve kalan 0,1 mililitre BLEs statini bir mililitre Tyros çözeltisi içinde seyreltin. Sonraki 20 dakika boyunca, tyros içindeki BLEs statini kanül yakınındaki bir ilaç portundan yavaşça enjekte edin.

BLE statin, hareket artefaktını kademeli olarak azaltacaktır. Ardından, 30 µL voltaja duyarlı boyayı bir mL tyro çözeltisi ile seyreltin ve bu karışımı beş ila yedi dakika boyunca yavaşça aynı ilaç portuna enjekte edin. Daha sonra aynı karışımı tekrar hazırlayın.

Bu aşamada, 30 µL ek kalsiyum indikatörü ekleyin. Bu karışımı aynı port üzerinden beş ila 10 dakika boyunca yavaşça uygulayın. Kalsiyum indikatörü enjekte edildikten sonra, deneye devam etmeden önce BLE'lerin statinle hareketi tamamen baskılaması ve boyaların hücrelere girmesi için beş ila 10 dakika daha bekleyin.

Bu kalp preparatı hazırlandı. Protokole uygun olarak, S1-S1 stimülasyonu ile ventriküler pacing sırasında EKG sinyalleri kaydedildi. Aksiyon potansiyelleri ve kalsiyum geçici sinyalleri soldaki atriyumlardan ve sağdaki ventriküllerden kaydedildi.

Ok, kamera kayıtlarının üç piksel çarpı üç piksellik birimler halinde gruplandırılmasıyla ventriküllerden gelen sinyal saçılımının gerçekleştiği yeri göstermektedir; böylece dizi verilerinden kalsiyum geçişleri ve aksiyon potansiyellerinden oluşan bir dizi görüntülenebilir. Aksiyon potansiyeli iletimini gösteren bir figür oluşturulabilir. Transvers ve longitudinal eksen üzerindeki birbirini takip eden üç noktadan elde edilen veriler, aksiyon potansiyelinin bir ventrikül yüzeyi boyunca yayılmasıyla birlikte meydana gelen genlik değişimini göstermektedir.

Benzer şekilde, aksiyon potansiyeli ve kalsiyum geçici süresini gösteren bir şekil oluşturulabilir. Bu şeklin solunda kontrol durumu, sağında ise deney durumu yer almaktadır. Kalbe yapılan isoproterenol enjeksiyonu, hem kalsiyum geçici sürelerini hem de aksiyon potansiyeli sürelerini belirgin şekilde kısaltmaktadır.

Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, bu prosedür takip edilerek iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. AV düğümünün refrakter dönemi ile ilgili olanlar gibi ek soruları yanıtlamak için pacing protokolü gibi diğer yöntemler uygulanabilir.