Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

Bu prosedürün genel amacı, bozulmamış izole LOR perfüze fare kalplerinde transmembran potansiyelini ve hücre içi kalsiyum geçişini aynı anda optik olarak haritalamaktır. Bu, önce sağlam fare kalbinin eksize edilmesi, ardından aortun kanüle edilmesi ve LOR perfüzyonunun başlatılmasıyla gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, kuplöre bir uyarma kasılması yükleyerek ve ardından kalbi perfüzyon odasına sabitleyerek kalbi hareketsiz hale getirmektir.

Son adımlar, optik boyaları yüklemek ve deney sırasında hareket artefaktlarını azaltmak için hazırlıklar yapmaktır. My cam Ultima LC Moss kameralar ile kalpten yayılan ışık toplanarak optik görüntüler elde edilir. Hey, benim adım di.

Washington Üniversitesi'nde yüksek lisans öğrencisiyim. Bu tekniğin mikro elektrot gibi mevcut yönteme göre ana avantajı, optik haritalamanın kalbin tüm yüzeyi üzerinde daha fazla uzamsal çözünürlüğe izin vermesidir. Merhaba, ben Matt Sulkin.

Washington Üniversitesi'nde yüksek lisans öğrencisiyim. Bu yöntem, doğru yapılırsa, aritmogenezin temeli gibi kardiyak elektrofizyolojideki birçok soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Çözeltileri dakikada 40 mililitre hızında dolaştırmak için bir peristaltik pompa yapılandırarak başlayın.

Ardından ikinci bir peristaltik pompayı dakikada 80 mililitreye ayarlayın. Bu pompa, Perfuse sekiz'i tutma ve oksijenleme rezervuarına geri döndürür. Pompaları açın ve sistemi bir litre,% 70 etanol ile 30 dakika devridaim ile yıkayın.

Bu yıkamayı devridaim yapmadan iki litre deiyonize su ile takip edin. Su tahliye edildikten sonra, iki litre Tyro solüsyonunu dolaştırın ve beş mikronluk bir filtreden geçirin. Perfüzu bir su ceketi ve sirkülatör kabarcığı oksijenli gaz ile sekiz ila 37 santigrat derece arasında ısıtın.

PH'ı 7,35 artı veya eksi 0,05'te tutmak için gaz köpürme oranını ayarlayın. Deney sırasında hem pH'ı hem de sıcaklığı izleyin. Çift optik haritalama aparatı, saniyede 3000 kare hızında 100 x 100 piksel görüntü yakalayabilen iki yüksek hızlı C yosun kamerasından oluşur.

Kalsiyum görüntüleme kamerasına bir bant geçiren filtre takın ve çift kamera tutucusundaki voltaj görüntüleme kamerasına uzun geçiren bir Filtre takın. Kalpten gelen emisyon ışığının lens tarafından aynaya odaklanması için bir diic ayna ve lens takın. Ayrıca, tutucuya iki kamera takın ve bunları birbirine dik olacak şekilde düzenleyin.

Ardından, uyarma ışığını ayarlayın. Işık, bir halojen lamba tarafından üretilir ve esnek bir ışık kılavuzu aracılığıyla yönlendirilir. Işığı bir ısı filtresinden, pozlamayı sınırlamak için bir deklanşörden ve bir uyarma bandı geçiş filtresinden geçirin.

Son olarak, gümüş ve gümüş klorür elektrotlarını hazneye yerleştirerek hazırlayın. Amplifikatörler ve filtrelerdeki seviyeleri iki kez kontrol ettikten ve ayarladıktan sonra, kurulum bir kalp için hazırdır. Devam etmeden önce bir fareyi uyuşturmak için 100 ünite heparin içeren bir ketamin ve ksilazin kokteyli kullanın.

Bir ayak parmağı tutamağı kullanarak hayvanın ağrı refleksi olmadığından emin olun. Orta sternal bir kesi yaptıktan sonra, kalbi ve çevresindeki dokuları hızlı bir şekilde çıkarın. Daha sonra diseksiyon mikroskobunu kullanarak hızlı bir şekilde aortu tanımlayın ve sağ subklavyen arterin altındaki çıkan aort boyunca temiz bir kesim yapın.

Şimdi aortun kısa bir bölümünü, dört oh siyah örgülü ipek sütür kullanarak özel yapım 21 gauge bir kanüle takın, Kanülasyondan sonra retro büyük ölçüde perfu ve kalbi süper kaynaştırın. Tyro solüsyonu ile aort basıncını 60 ila 80 milimetre arasında tutmak için akış hızını ayarlayın. Bir basınç dönüştürücü tarafından ölçülen cıva.

Şimdi çevredeki akciğer, timus ve yağ dokusunu inceleyin ve çıkarın. Şimdi pulmoner venlerden sol ventriküle silikon bir tüp yerleştirin. Tüpü yakındaki bağ dokusuna dikin.

Bu çok önemli adım, özellikle ventriküler kasılmaların baskılanmasından sonra sol ventrikülde sıkışan Perfuse sekiz'in tıkanmasını ve asitlenmesini önler. Perfuse sekizinin neden olduğu kalp hareketlerini önlemek için, kalbi eşik koruyucu kaplı perfüzyon odasının tepesindeki dibine sabitleyin. Ayrıca, dik konfigürasyonda atriyumun yüzey alanını artırmak için sağ ve sol atriyal uzantıları gerin ve sabitleyin.

Bu, kayıt yüzey alanını en üst düzeye çıkaracaktır. Pacing stimülasyonlarını gerçekleştirmek için, kalbin yüzeyine özel yapım bir elektrot takın. Hareket artefaktlarını azaltmak için, çözelti yüzeyindeki kalbin üzerine küçük bir kapak camı sabitleyin.

Bunu, camı birkaç pim arasına sıkıştırarak yapın. Son hazırlıklar olarak, uyarma ışığını kalbe odaklayın ve kameraları optik bir görüntü elde edecek şekilde konumlandırın, ardından kalıpları yüklerken boyayı yüklemeye başlayın. Kalbin normal elektriksel fonksiyonunu sağlamak için EKG kayıtlarını sürekli olarak izleyin.

BLE'lerin statinini oda sıcaklığına ısıtmakla başlayın. Daha sonra yarım mililitre BLE statinini tutma rezervuarındaki bol sekize karıştırın ve kalan 10. mililitre BLE statinini bir mililitre Tyros çözeltisine seyreltin. Önümüzdeki 20 dakika boyunca, kanülün yakınındaki bir ilaç portundan tyros'taki BLE'lerin statinini yavaşça enjekte edin.

BLE'nin statini, hareket artefaktını kademeli olarak azaltacaktır. Daha sonra, 30 mikrolitre voltaja duyarlı boyayı bir mililitre tiro çözeltisine seyreltin ve bu karışımı aynı ilaç portuna beş ila yedi dakika boyunca yavaşça enjekte edin. Sonra aynı karışımı tekrar yapın.

Bu sefer, 30 mikrolitre daha kalsiyum göstergesi ekliyor. Bu karışımı aynı porttan beş ila 10 dakika boyunca yavaşça uygulayın. Kalsiyum indikatörü enjekte edildikten sonra, deneye devam etmeden önce BLE'nin statininin hareketi tamamen bastırması ve boyaların hücrelere girmesi için beş ila 10 dakika daha bekleyin.

Bu kalp hazırlığı yapıldı. Protokole göre, EKG sinyalleri ventriküler pacing sırasında S one S one stimülasyonundan kaydedildi. Soldaki atriyumdan ve sağdaki ventriküllerden aksiyon potansiyelleri ve kalsiyum geçici sinyalleri kaydedildi.

Ok, kameradan gelen kayıtların üç piksele üç piksellik birimler halinde gruplandırılmasıyla ventriküllerden gelen sinyal saçılımının nerede meydana geldiğini gösterir, dizi verilerinden bir dizi kalsiyum geçici akımı ve aksiyon potansiyeli görüntülenebilir. Aksiyon potansiyeli iletimini gösteren bir şekil oluşturulabilir. Enine ve boyuna eksen üzerindeki ardışık üç noktadan elde edilen veriler, aksiyon potansiyelinin bir ventriküler yüzey boyunca yayılmasıyla genlik değişimini gösterir.

Benzer şekilde, aksiyon potansiyelini ve kalsiyum geçici sürelerini gösteren bir şekil oluşturulabilir. Bu, solda sağda bir kontrol koşulunu gösterir. Kalbe bir izoproterenol enjeksiyonu yapıldı, bu da hem kalsiyum geçişlerinin hem de aksiyon potansiyellerinin süresini açıkça kısalttı.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik bu prosedürü takiben iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. AV düğümünün refrakter periyodu ile ilgili olanlar gibi ek soruları yanıtlamak için pacing protokolü gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.