Name: RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Öğrenin Pseudomonas aeruginosa için güvenilir RNA izolasyon yöntemini murin gastrointestinal yoldan. Bu teknik, qPCR ve RNA dizileme için yüksek kaliteli RNA sağlar ve gen ekspresyonu çalışmalarında kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağlık hibe AI62983 (AYK), AI22535 (GPB) tarafından finanse edildi.

1. P. murin Modeli aeruginosa GI Kolonizasyon ve Yaygınlaştırma <ol><li> Komensal florası tüketmek ve daha sonra daha önce 4 açıklandığı gibi mono-PA ile kolonize C3H/HeN fareler (6-8 hafta eski kadın, Harlan) oral antibiyotik ile tedavi edilir. </li></ol> 2. Murin Çekal Luminal İçeriği Hasat <ol><li> Sıvı azot banyo temizlenir paslanmaz çelik harcı bırakın. </li><li> Karbondioksit boğulma tarafından fareler Euthanize. </li><li> Strafor kurulu ve% 95 etanol ile duş Güvenli fare karkas. Sternum perine deri yoluyla orta hat longitudinal kesi olun. Deri ve periton karın boşluğunda maruz yansıtmaktadır. </li><li> Tüm çekum rezeke. Çekum paslanmaz çelik harç üzerinde forseps ile tutun. Çekum diseksiyon makas ile her iki ucunda Snip. </li><li> Çekum proksimal ucunu çekal flushate tamponu (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA ve 200 mM NaCl) 5 1 ml ile dolu bir P1000 pipet ucu takın. Paslanmaz çelik harç çekal flushate tampon ve çekal luminal içeriği yıkayın. 1 ml çekal flushate tampon çekal içeriğinin tüm ateş basması için yeterli olacaktır. Çekal flushate içeriğini harç ile temas halinde hemen donar. </li><li> Steril bir havaneli çekal flushate içeriğini Grind. </li><li> Yeri zemin kuru buz / etanol banyosu içinde batık bir 50 ml polipropilen konik tüp içine çekal luminal içeriğini donmuş. </li><li> Her ek fare için 2.7 üzerinden 2.2 adımları tekrarlayın. </li><li> -80 ° C saklayınız </li></ol> 3. Bakteriyel RNA İzolasyon <ol><li> 65 parafilm güvenli bir şekilde kapak ile 50 ml Oak Ridge santrifüj tüpüne bulunan asit kloroform / fenol Sıcak 1 hacmi (yaklaşık 3 ml, iki çekal luminal içeriği son hacmi dayalı) (5:1, v / v) ° C su banyosu. </li><li> 5 dakika için 50 ml polipropilen konik tüp bulunan lizis tamponu 0.5 hacmi (2% SDS, 16 mM EDTA ve 200 mM NaCl) 6 kaynatın. </li><li> Çekal luminal içeriğine kaynar lizis tamponu ekleyin. Homojenize edilir. Periyodik vorteks ile 5 dakika boyunca kaynatın. </li><li> Ekle 100 ° C ila 65 ° C Oak Ridge santrifüj tüpüne asit kloroform / fenol çekal içeriğini / lizis örnek. Parafilm ile Seal kap. </li><li> 65 ° C'de 10 dakika boyunca periyodik olarak vorteks (her 2 dakika). </li><li> 4 ° de 15 dakika boyunca 2.500 g örnek santrifüjleyin. </li><li> 50 ml taze bir Oak Ridge santrifüj dikkatlice sulu faz (beyaz arabirimi herhangi bir kaçınarak) aktarın. Sulu fazın hacmi çekal içeriği, lizis tamponu, asit ve kloroform / fenol toplam hacminin yaklaşık% 50 olacaktır. Eşit miktarda asit kloroform / fenol ekleyin. </li><li> Seal parafilm kapağı ve yüksek hızda karıştırın iyice karıştırın. </li><li> 4 ° de 15 dakika boyunca 2.500 g örnek santrifüjleyin. </li><li> 3,9 için 3,7 Adımlar görünür beyaz, sulu ve organik fazlar arasında arayüz kalmayıncaya kadar tekrarlayın. </li><li> Sulu faz 50 ml taze bir Oak Ridge santrifüj dikkatlice aktarın. Kloroform / izoamil alkol (24:1, v / v) eşit miktarda ekleyin. </li><li> Mühür kapak ve vorteks ile iyice karıştırın. </li><li> 4 ° de 15 dakika boyunca 2.500 g örnek santrifüjleyin. 15 ml polipropilen konik tüp sulu faz (hacmi toplam reaksiyon hacmi yaklaşık% 50 olacak) çıkarın ve eşit hacimde izopropanol ekleyin. </li><li> -20 ° 'de en az 2 saat veya gece boyunca inkübe edin. </li><li> 2.500 g örnek için 45 dakika 4 ° santrifüjleyin. Jel gibi pelet bir tüpün dibinde oluşturacaktır. Süpernatantı. </li><li> Pelet 1 ml% 70 etanol buz ile yıkayın. Vorteks. 5 dakika boyunca 4 ° 10,000 g örnek Santrifüj. </li><li> Süpernatantı alın ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında pelet kuruması için tüp ters. </li><li> RNaz içermeyen su 200 ul RNA pelletini tekrar. </li></ol> 4. DNaz Tedavi (Turbo DNA-Free, Uygulamalı Biyosistem) <ol><li> 10X Turbo DNaz tampon ve 2 ul Turbo DNaz 20 ul ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> 37 ° de 20 dakika inkübe edin. </li><li> 20 ul yeniden süspanse DNaz inaktivasyon reaktif ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Ara sıra karıştırarak oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> 1.5 dakika boyunca oda sıcaklığında 10.000 g de santrifüj ve yeni bir mikrofuge'ye boru süpernatantı transfer. </li><li> Bir hacim fenol / kloroform soğuk (4 °) asit ekleyin ve 1 dakika için vorteks ile iyice karıştırın. </li><li> 12.500 g oda sıcaklığında 2 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Sulu faz yeni bir tüpe transfer ve 1 hacim kloroform / izoamil alkol (49:1 v / v), girdap ekleyin. </li><li> 12.500 g oda sıcaklığında 2 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> (Toplam reaksiyon hacminin yaklaşık% 50) sulu faz yeni bir tüpe aktarın. </li><li> 3M sodyum asetat, pH 5.5 0.1 hacim ekleBuz gibi% 100 etanol 2.5 hacimleri. Vorteks. </li><li> En az 2 saat veya -20 ° -80 ° 'de 30 dakika inkübe edin. </li><li> 12.000 gr santrifüjleyin az 30 dakika süreyle 4 ° </li><li> Süpernatantı. </li><li> 10.000 g 4 ° 'de 5 dakika santrifüj pelet 1 ml% 70 etanol buz ile yıkayın. </li><li> 10 dakika boyunca supernatant ve kuru hava çıkarın. </li><li> RNaz ücretsiz su 100 ul pelletini tekrar. Tekrar süspansiyon 65 ° su banyosu yeri ve pelet çözülür gerekebilir. </li><li> DNaz tedavinin etkinliğini test etmek için, ribozomal protein (veya başka bir referans gen) amplifikasyonu için bir standart RT-PCR reaksiyonu hiçbir RT kontrollerini kullanarak arıtılmış ve arıtılmamış örnekleri olabilir. </li></ol> 5. RNA Temizleme Adım (Qiagen, RNeasy Kiti) <ol><li> Qiagen RNeasy Mini El Kitabı (4. Edition, Nisan 2006) sayfa 56-57 bakın. Gösterildiği gibi uygulayın. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Bu protokolü kullanarak ele bakteriyel toplam RNA miktarını iki cecums yaklaşık 2-3 mg. Kurtarıldı RNA sonraki qPCR, transkripsiyon profilleme ve RNA Seq deneyler için yeterli nicelik ve nitelik taşımaktadır. RNA saflık rutin 260nm/280nm oranı 7 numunenin ölçümü ile değerlendirilen, henüz bu yöntem hakkında hiçbir bilgi RNA bütünlüğünü sağlar. Agilent Bioanalyzer boyutlandırma, ölçme ve kalite kontrol, DNA, RNA, proteinler ve hücreler için bir Mikroakiskan tabanlı bir platform ve RNA Bütünlük sayısı (RIN) 8 olarak bilinen bir RNA bütünlüğünü metrik kullanır . Bu protokol 260/280 1.7 'den 2.0' ye ve RIN değerleri ≥ 7.0 arasında değişen oranlar üretir RNA ayıklanır. Bu protokol tarafından kurtarıldı bakteriyel RNA Agilent Bioanalyzer analizi bir örnek Şekil 1'de gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/3293/3293fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: Agilent Bioanalyzer Elektroferogram ve Pseudomonas aeruginosa toplam RNA örnek jel gibi görüntü izole ve fare çekal içeriği kurtarıldı. RIN 8.0.

<ol><li>Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+caused+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Infections caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).</li>
<li>Bertrand, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endemicity%2C+molecular+diversity+and+colonisation+routes+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units.</a> Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).</li>
<li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+in+vivo+transcription+profiling+for+identifying+Pseudomonas+aeruginosa+genes+needed+for+gastrointestinal+colonization+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination.</a> PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).</li>
<li>Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+murine+model+of+gastrointestinal+colonization+and+dissemination+in+neutropenia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia.</a> Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).</li>
<li>Alexander, R. J., Raicht, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+total+RNA+from+human+stool+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification of total RNA from human stool samples.</a> Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).</li>
<li>Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+gene+expression+detected+in+human+faeces+by+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR.</a> J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).</li>
<li>Manchester, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+UV+methods+for+measurement+of+protein+and+nucleic+acid+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations.</a> Biotechniques. 20, 968-970 (1996).</li>
<li>Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).</li>
<li>Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+gut+microbiome+in+obese+and+lean+twins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A core gut microbiome in obese and lean twins.</a> Nature. 457, 480-484 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

RNA ekstraksiyon yöntemi, burada açıklanan kurtarma için fare GI yolu hasat yüksek kaliteli Pseudomonas aeruginosa toplam RNA yeterli miktarda sağlar . Bu yöntem, P. ile sınırlı değildir aeruginosa ve diğer bakterilerin potansiyel olarak uygulanabilir. Yeterli mikrobik organizmaların bağırsak kurtarma organizmadan organizmaya önemli ölçüde değişecektir. Bizim fare modeli, P. aeruginosa genellikle 5 x 10 7 5 x 10 8 kob / g feçes 4 arasındaki seviyelerde fare gastrointestinal sistem kolonize. Kurtarılan çekal içeriği kabaca 0.5 gram, P. tahmini sayısı olduğundan iki cecums kurtarıldı aeruginosa 5 x 10 7 5 x 10 8 kob arasında. Diğer mikroorganizmaların kullanılması halinde, gastrointestinal kolonizasyon seviyesini doğrulamak ve daha sonra hedeflenen sayıda kob kurtarmak için gerekli cecums sayısını hesaplamak için ihtiyatlı bir davranış olacaktır. Bu özel fare modeli kullanırken, PA ile enfekte olmayan antibiyotik ile tedavi edilen farelerde çekal içeriğini izole edilen RNA ölçülebilir miktarda olduğunu da not etmek önemlidir. Pseudomonas aeruginosa gastrointestinal kolonizasyon ve yaygınlaştırma girişimleri P. patogenezinde taklit etmek için fare modeli kanser ve kök hücre nakli yapılan hastaları bakteriyemi aeruginosa . Bu hasta popülasyonunda, ortakçı florasının genellikle antibiyotik veya kemoterapötik tedavi (GI ortakçı floranın antibiyotik tükenmesi gibi) patojen mikropların (örneğin P. aeruginosa ile mono-dernek) aşırı üremesine neden tükenmiş ve bağışıklık baskılanması sonra sonraki yayılması. Bu fare modelinin avantajları ve sınırlamaları zaten daha önce 4 olarak ele alınmıştır . Bu çalışmanın amacı, GI yolu mikrobik total RNA izole etmek için bir metodoloji sunmaktır. Bu protokol, gastrointestinal sistem (yani ortakçı flora etkileşimleri, inflamatuvar barsak hastalığı gibi bakteriyel etkileri) mikrobiyal patogenez diğer yönlerini incelemek diğer fare modelleri kolayca adapte edilebilir. Bu yöntemin bir avantajı, donma / çözülme, mekanik parçalama (harç / havaneli, homojenizasyon ile ezerek), kaynama, kimyasal ve lizis (örneğin SDS) de dahil olmak üzere birden fazla lizis adımları birleşme olduğunu. Lizis adımları çokluğuna rağmen, bazı mikroorganizmaların (özellikle Gram-pozitif bakteri ve mantar / maya) ilave mekanik bozulması gerekebilir. Sıcak lizis / asit, fenol-kloroform inkübasyon (Adım 3.5), boncuk ek (bakteri ve maya / veya 0.5-0.7 mm 0,1 mm) ve bir sonraki boncuk atan adım sonra, bu organizmalar 9 lyse için yeterli olmalıdır 10 Fare çekum, tekrarlayan soğuk acid-phenol/chloroform ekstraksiyon (Adım 3,7-3,9) kurtarıldı malzemelerin karmaşık doğası gereği kesinlikle daha aşağı reaksiyonlar için kabul edilebilir RNA kalitesini ve bütünlüğünü sağlamak için gerekli. 3-5 soğuk acid-phenol/chloroform ekstraksiyon arasında elimine edilir, sulu ve organik fazlar arasında beyaz bir arayüz önce gerekli olabilir. Son olarak, DNaz tedavi (Adım 4) ve RNeasy Temizleme Protokolü (Adım 5) kombinasyonu kirlenmesine neden olan DNA ve mRNA küçük olmayan (5s ve tRNA) kaldırmak için gereklidir. Daha önce de belirtildiği gibi, bu protokol kullanan tarafından kurtarıldı RNA sonraki transkripsiyon profil 3, qPCR (yayımlanmamış), ve RNA Seq (yayımlanmamış) deneyler için yeterli miktar ve kalitede.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Havanda </td><td> Balıkçı </td><td> 12-947-1 </td></tr><tr><td> Homojenizatör </td><td> Omni </td><td> TM-125 </td></tr><tr><td> Oak Ridge santrifüj tüplerine (50 ml) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td></tr><tr><td> Asit Fenol / Kloroform </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td></tr><tr><td> Kloroform </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2432 </td></tr><tr><td> Izoamil Alkol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W205702 </td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 190764 </td></tr><tr><td> Dietil pyrocarbonate (DEPC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 40718 </td></tr><tr><td> DNaz </td><td> Ambion </td><td> AM2238 </td></tr><tr><td> RNeasy Seti </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> 3M Sodyum Asetat </td><td> Ambion </td><td> AM9740 </td></tr><tr><td> % 100 Etanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7023 </td></tr></tbody></table>

rna İzolasyonu pseudomonas aeruginosa murin gastrointestinal yolu koloniler

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Lösemili hastalarda, ağır yanık yaraları, veya organ nakli 1 gibi bağışıklık sistemleri ile ev sahipliği yapan önemli bir morbidite ve mortalite Pseudomonas aeruginosa (PA) enfeksiyonları sonucu. PA kan dolaşımı enfeksiyonu geliştirme için yüksek riskli hastalarda, gastrointestinal (Gİ) sistem 2 kolonizasyon için ana rezervuar, ancak mekanizmaları olan asemptomatik kolonize mikrop invaziv, ve genellikle ölümcül PA geçişler, patojen belirsizdir. Daha önce, konağın bağışıklık durumu değişiklikler sırasında bakteriyel gen ekspresyonu değişiklikleri belirlemek amacıyla fareler 3 kolonize cecums yaşayan bakteri hücrelerinin PA mRNA kurtarma in vivo transkripsiyon profili deneyleri yapıldı. Herhangi bir transkripsiyon profil deneyde olduğu gibi, hız sınırlayıcı adım yeterli miktarda yüksek kaliteli mRNA izolasyonu. Enzimler, moloz, gıda artıkları ve GI kanalda partikül madde bolluğu göz önüne alındığında, RNA izolasyonu meydan yıldırıcı. Burada, biz, güvenilir ve tekrarlanabilir fare GI sistem kurtarıldı bakteriyel RNA izolasyonu için bir yöntem mevcut. Bu yöntem, PA gastrointestinal kolonizasyon ve nötropeni indüklenen yayılması 4 köklü bir fare modeli kullanmaktadır. PA ile bir kez gastrointestinal kolonizasyon doğruladı, fareler, ötenazi ve çekal içeriğini kurtarıldı ve flash dondurulur. RNA sonra kaynar bozulması, mekanik, fenol / kloroform ekstraksiyon, DNaz tedavi ve afinite kromatografisi bir kombinasyonu kullanılarak elde edilir. Miktar ve saflık spektrofotometri (Nanodrop Teknolojileri) ve bioanalyzer (Agilent Technologies) (Şekil 1) tarafından teyit edilir. GI mikrobiyal RNA izolasyonu Bu yöntem yanı sıra diğer bakteri ve mantarlar kolayca adapte edilebilir.

RNA izolasyonu için güvenilir bir yöntem<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Fare cecums kurtarıldı açıklanmıştır. Kurtarıldı RNA sonraki qPCR, transkripsiyon profilleme ve RNA Seq deneyler için yeterli nicelik ve nitelik taşımaktadır. Bu teknik diğer bağırsak mikropların RNA izolasyonu için adapte edilebilir.

RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Pseudomonas aeruginosa (PA) enfeksiyonları, ... hastaları gibi bağışıklık sistemi baskılanmış konakçılarda önemli morbidite ve mortaliteye neden olmaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, fare ECM'lerinden geri kazanılan Pseudomonas aerogen'in toplam RNA'sını izole etmektir. Bu işlem, öncelikle sekül lüminal içeriklerin toplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, bakteriyel RNA izole edilir.Ardından D'S işlemi ve RNA temizliği gerçekleştirilir. Son olarak, RNA miktarı belirlenir ve izolatın saflığı biyanalizör ve spektrofotometrik analiz ile kontrol edilir. Nihayetinde, QPCR, analiz, transkripsiyon profilleme veya RNA dizileme deneyleri gibi sonraki deneysel değerlendirmeler için yeterli kalite ve miktarda bakteriyel RNA elde edilebilir.Bu tekniğin triol ekstraksiyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yüksek kaliteli RNA sağlamak için son derece titiz asit ortamında çoklu lizis aşamalarını ve kloroform ekstraksiyon aşamalarını içermesidir. Lizis ve ekstraksiyon aşamaları, yazılı protokollerin başarı için kritik olan küçük ayrıntıları atlaması nedeniyle öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel bir gösterimi kritik öneme sahiptir. Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Eduardo Lopez Medina ve laboratuvar yöneticisi Megan Neubauer uygulamalı olarak gösterecektir. Hasada başlamadan önce, IMSA paslanmaz çelik havandaki kalıntıları sıvı azot banyosunda temizler.Ardından, pseudomonas aerogen kolonize edilmiş altı ila sekiz haftalık bir C3 HHEN fareyi ötanize ettikten sonra, hayvanı bir strafor tahta üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve karın bölgesini %95 ethanol ile yıkayın. Sonra, sternumdan perineuma kadar deri üzerinden orta hat boyunca boylamasına bir insizyon yapın. Ardından deri ve peritonu geri çekerek karın boşluğunu açığa çıkarın.Şimdi pens kullanarak sekumun tamamını rezeke edin. Sekumu paslanmaz çelik havanda tutun ve ardından diseksiyon makası ile sekumun her iki ucunu kesin. Bir P 1000 pipet ucunu bir mililitre sequel flush eight tamponu ile doldurun ve ardından ucu sekumun proksimal ucuna yerleştirin.Sekel flush eight tamponunu ve sekel lümen içeriğini paslanmaz çelik havana aktarın. Şimdi sekel flush eight içeriğini steril bir havan eli ile ezin.Ardından, bir kaba kuru buz üzerine etanol dökün ve 50 mililitrelik bir polipropilen konik tüpü kuru buz etanol banyosuna yerleştirin. Öğütülmüş dondurulmuş sekum lümen içeriğini konik tüpe aktarın ve tüpü -80 °C'de saklayın. Prosedürün bundan sonraki adımları, işlemin en zor kısımlarıdır.MI sekumundan elde edilen materyallerin karmaşık doğası nedeniyle, kabul edilebilir bir homojenlik ve bütünlük sağlamak için tekrarlanan soğuk filoform ekstraksiyonları kesinlikle gereklidir; sulu ve organik fazlar arasındaki geniş ara yüz ortadan kaldırılmadan önce üç ila beş ekstraksiyon gerekebilir. Bir birim asit fenol kloroformu 50 mililitrelik bir Oak Ridge santrifüj tüpüne aktarın. Kapağı sıkıca kapatın ve ardından tüpü 65 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.Bir 50 milliliter polipropilen konik tüpe yarım hacim lizis tamponu koyun ve ardından tamponu beş dakika boyunca kaynatın. -80 degrees Celsius depolama alanından çıkarılan sequel luminal içeriklerini, tüpü elinizle hızlıca ovarak kısa süreliğine ısıtın ve ardından kaynayan lizis tamponunu tüpe ekleyin. Lizis tamponunun SQL luminal içerik çözeltisini homojenize etmek için karışımı çalkalayın.Lizis tamponunu ve SQL luminal içeriğini beş dakika boyunca kaynatın. Periyodik vorteksleme yaparak, fenol kloroform çözeltisini içeren Oak Ridge santrifüj tüpünün kapağını açın ve SQL içerikli lizis örneğini tüpe aktarın. Ardından kapağı Parafilm ile yeniden kapatın ve tüpü, her iki dakikada bir çalkalayarak 65 °C'lik su banyosunda 10 dakika boyunca bekletin.Numuneyi 4 °C'de 15 dakika boyunca 2.500 ×g'de yıkayın. Ardından, beyaz ara yüzeye temas etmemeye dikkat ederek sulu fazı dikkatlice yeni bir 50 ml Oak Ridge santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra yeni tüpe eşit hacimde asit fenol kloroform ekleyin.Kapağı parafilm ile sızdırmaz hale getirin ve tüpü yüksek hızda vorteksleyerek içeriği iyice karıştırın. Örneği santrifüj etmeye ve sulu fazı santrifüj tüpüne aktarmaya devam edin. Üstteki sulu fazın hacmi çok küçülürse, daha küçük çaplı bir tüpe aktarılabilir.Sulu ve organik fazlar arasında görünür beyaz bir ara yüz kalmayana kadar bu işleme devam edin. Beyaz ara yüz kaybolduğunda, sulu fazı dikkatlice yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından tüpe eşit hacimde kloroform, izoamil alkol ekleyin, kapağı kapatın ve içeriği vorteksleyerek iyice karıştırın.Ardından, örneği tekrar santrifüj ettikten sonra sulu fazı 15 milliliter polipropilen konik tüpe aktarın ve eşit hacimde isopropanol ekleyin. Daha sonra çözeltiyi en az iki saat veya gece boyunca -20 °C'de inkübe edin. Örneği inkübe ettikten sonra tüpü 45 dakika boyunca santrifüjleyin.Tüpün altındaki jel benzeri pelet belirlendikten sonra süpernatanı uzaklaştırın. Şimdi, tüpü vorteksleyerek peleti bir mililitre buz gibi soğuk, %70 etanol ile yıkayın ve ardından numuneyi dört santigrat derecede beş dakika boyunca 10.000 ×g hızında santrifüjleyin. Son olarak, süpernatanı uzaklaştırın ve peletin oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava ile kurumasını sağlamak için tüpü ters çevirin.Ardından RNA peletini 200 µL RNase içermeyen suda yeniden süspande edin. İlk olarak, mikro santrifüj tüpüne 20 µL 10x Turbo DNA tamponu ve 2 µL Turbo DNase ekleyip çözeltiyi nazikçe karıştırın. Daha sonra tüpü 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin ve ardından tüpe 20 µL yeniden süspande edilmiş DNA inaktivasyon reaktifi ekleyip iyice karıştırın.Şimdi tüpü, ara ara karıştırarak oda sıcaklığında beş dakika daha inkübe edin. Ardından, peleti bir mikro santrifüjde 10,000 ×g hızında 1,5 dakika boyunca çöktürün ve ardından süpernatanı yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Pelete bir hacim soğuk asit fenol kloroform ekleyin ve ardından çözeltiyi bir dakika boyunca vorteksleyerek iyice karıştırın.Çözeltiyi 12,500 ×g'de iki dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, sulu fazı yeni bir tüpe aktarın ve bir hacim kloroform izoamil alkol ekleyin. Ardından, çözeltiyi aynı koşullar altında tekrar santrifüj ettikten sonra vorteksleyerek karıştırın. Sulu fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Ardından, 0,1 hacim üç molar sodyum asetat ve 2,5 hacim buz gibi soğuk %100 etanol ekleyin. Karıştırmak için tüpü vorteksleyin. Örneği -80 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, 4 °C'de 30 dakika boyunca 12,000 ×g'de santrifüj ettikten sonra süpernatantı uzaklaştırın. Son olarak, peleti 1 ml buz gibi soğuk %70 etanol ile yıkayın. Süpernatantı uzaklaştırın ve peleti 10 dakika boyunca havada kurutun.Ardından pellet'i 100 µL RNase içermeyen su içerisinde yeniden süspande edin. Agilent Bioanalyzer; DNA, RNA, protein ve hücrelerin boyutlandırılması, miktar tayini ve kalite kontrolü için kullanılan mikroakışkan tabanlı bir platformdur ve RNA bütünlük numarası veya RIN olarak bilinen bir RNA bütünlük metriği kullanır. Bu protokol ile ekstrakte edilen örnekler, 1,7 ile 2,0 arasında değişen 260/280 oranları ve 7,0'a eşit veya daha büyük RIN değerleri üretir.Bakteriyel RNA'ya ait bir Agilent bioanalyzer elektroferogram örneği burada solda, fare SQL içeriklerinden geri kazanılan pseudomonas arosa'nın jel benzeri görüntüsü ise burada sağda gösterilmiştir. Bu prosedürün ardından, rafine gen ekspresyon profillemesi gibi ek soruları yanıtlamak için kantitatif PCR veya RNA sekanslama gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

rna-isolation-pseudomonas-aeruginosa-colonizing-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Morrill, S.R., ve diğerleri. Anaerobik olarak yetiştirilen bakteriler tarafından murin vajinal kolonizasyon modelleri. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, antibiyotiğe dirençli anaerobik bakteriler kullanılarak farelerde vajinal kolonizasyonun modellenmesine yönelik bir protokolü göstermektedir. Epitel duyarlılığını artırmak için hormonal tedavi ile başlar, ardından anaerobik koşullar altında vajinal aşılama ve ko-aşılama ile devam eder. Prosedür, bakteri kolonizasyonunu ve biyofilm oluşumunu...

Murin Vajinal Kolonizasyonunun Anaerobik Bakterilerle Modellenmesi

Kaynak: Taylor, M.N., et.al. Caenorhabditis elegans-Bakteriyel Etkileşimlerde Heterojenliği Ölçmek için Tek Solucan Verilerini Kullanma. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, mikropsuz, yaşları uyumlu Caenorhabditis elegans solucanlarının bağırsak kolonizasyonu için bir bakteri suşuna maruz kalmasını göstermektedir. Yapışmamış ve harici bakterilerin seçici olarak uzaklaştırılmasını açıklar ve miktar tayini için bağırsak epiteline yalnızca canlı bakteriler yapışır.

Mikropsuz C. elegans'de Bağırsak Bakteri Kolonizasyonunun Değerlendirilmesi

Murine nazofarenksin Streptococcus pneumoniae ile kolonizasyonu ve daha sonra yapışık veya işe alınan hücrelerin çıkarılması açıklanmaktadır. Bu teknik, nazofarenksin yıkanmasını ve sıvının nares yoluyla toplanmasını içerir ve diferansiyel hücre niceliği ve mRNA ekspresyonunun yerinde analizi dedahil olmak üzere çeşitli okumalar için uyarlanabilir.

Streptococcus pneumoniae ile İntranazal Kolonizasyon Sırasında İnflamatuar Yanıtların Karakterizasyonu

Wormsorter floresan gazetecilere ifadeye göre solucanlar sıralayarak Caenorhabditis elegans genetik ekranları kolaylaştırır. Burada, yeni bir kullanımını tanımlamak: GFP-ifade patojen tarafından kolonizasyon göre sıralama, ve biz bağışıklık tepkilerini başlatarak patojen tanıma anlaşılamamıştır rolünü incelemek için istihdam.

Otomatik Ayırma<em&gt; C. elegans</em&gt; Değişken derecelerde Bakteriyel Patojen tarafından kolonileştirildiğini

Burada bir prosedür, Escherichia coli K1 kültürleri ile neonatal sıçanda sistemik enfeksiyon kurulması için tarif edilmiştir. Bu non-invazif prosedür da koroid pleksusa de mide-bağırsak yolunun kolonizasyonu, sistemik dolaşıma patojenin translokasyonu ve merkezi sinir sisteminin istilası izin verir.

Neuropathogenic olmayan İnvaziv Modeli Escherichia coli Yenidoğan Sıçan Enfeksiyon

Burada, abd gıda ve ilaç İdaresi (FDA) onaylı Escherichia coli ticari uygulamalar için karşılaştırıldığında Pseudomonas aeruginosa genetik olarak değiştirilmiş suşlarının zayıflamasını değerlendirmek için enfeksiyon fare modelibasit ve tekrarlanabilir bir protokol açıklar.

Pseudomonas aeruginosa In-Frame Gen Silme Mutantlar Üretimi ve Enfeksiyon Basit Bir Fare Modelinde Virülans Zayıflama sıiçin Test

Gizli hücre içi mesane rezervuarları oluşturmak için üropatojenik E. coli (UPEC) transüretral aşılamasının bir fare modeli ve tekrarlayan UPEC İYE'yi indüklemek için G. vajinalis'e mesane maruziyeti gösterilmiştir.  Ayrıca bakterilerin sayımı, idrar sitolojisi ve in situ mesane fiksasyonu ve taramalı elektron mikroskobu için işlenmesi de gösterilmiştir.

Farelerde Gardnerella vaginalis Mesane Maruziyeti Tarafından Tetiklenen Tekrarlayan Escherichia coli İdrar Yolu Enfeksiyonu

Protokol, anaerobik olarak kültürlenmiş insan vajinal bakterileri ile vajinal kolonizasyonun bir fare modelini sunar. Prevotella bivia ve Fusobacterium nucleatum için öneriler eklerken Gardnerella vaginalis'e odaklanıyoruz. Bu protokol aynı zamanda vajinal aşılamalar ve diğer anaerobik olarak yetiştirilen bakterilerin canlı iyileşmesi için bir rehber olarak da kullanılabilir.

Yapay Olarak Yetiştirilen Bakteriler Tarafından Murin Vajinal Kolonizasyon Modelleri

Caenorhabditis elegans , biyolojideki ana model türlerden biridir, ancak neredeyse tüm araştırmalar doğal olarak ilişkili mikroplarının yokluğunda gerçekleştirilir. Burada açıklanan yöntemler, gelecekteki fonksiyonel C. elegans araştırmalarının temeli olarak ilişkili mikropların çeşitliliği hakkındaki anlayışımızı geliştirmeye yardımcı olacaktır.

Model Nematod Caenorhabditis elegans'ın Doğal Mikrobiyotasının İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu protokol, pks+ Escherichia coli farelerinin inflamatuar olmayan koşullarda kolonileşmesi için gerekli adımları, ayrıca kolonizasyonun doğrulanması ve dışkıda pks+ E. coli genişlemesinin değerlendirilmesi için invaziv olmayan yöntemleri tanımlar.

Murine pks+ Escherichia coli ile İltihap Olmayan Koşullarda Kolonizasyon

Öğrenin Pseudomonas aeruginosa için güvenilir RNA izolasyon yöntemini murin gastrointestinal yoldan. Bu teknik, qPCR ve RNA dizileme için yüksek kaliteli RNA sağlar ve gen ekspresyonu çalışmalarında kullanılabilir.

RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Daha fazla video keşfet