RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Bu prosedürün genel amacı, fare ECM'lerinden geri kazanılan Pseudomonas aerogen'in toplam RNA'sını izole etmektir. Bu işlem, öncelikle sekül lüminal içeriklerin toplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, bakteriyel RNA izole edilir.

Ardından D'S işlemi ve RNA temizliği gerçekleştirilir. Son olarak, RNA miktarı belirlenir ve izolatın saflığı biyanalizör ve spektrofotometrik analiz ile kontrol edilir. Nihayetinde, QPCR, analiz, transkripsiyon profilleme veya RNA dizileme deneyleri gibi sonraki deneysel değerlendirmeler için yeterli kalite ve miktarda bakteriyel RNA elde edilebilir.

Bu tekniğin triol ekstraksiyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yüksek kaliteli RNA sağlamak için son derece titiz asit ortamında çoklu lizis aşamalarını ve kloroform ekstraksiyon aşamalarını içermesidir. Lizis ve ekstraksiyon aşamaları, yazılı protokollerin başarı için kritik olan küçük ayrıntıları atlaması nedeniyle öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel bir gösterimi kritik öneme sahiptir. Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Eduardo Lopez Medina ve laboratuvar yöneticisi Megan Neubauer uygulamalı olarak gösterecektir. Hasada başlamadan önce, IMSA paslanmaz çelik havandaki kalıntıları sıvı azot banyosunda temizler.

Ardından, pseudomonas aerogen kolonize edilmiş altı ila sekiz haftalık bir C3 HHEN fareyi ötanize ettikten sonra, hayvanı bir strafor tahta üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve karın bölgesini %95 ethanol ile yıkayın. Sonra, sternumdan perineuma kadar deri üzerinden orta hat boyunca boylamasına bir insizyon yapın. Ardından deri ve peritonu geri çekerek karın boşluğunu açığa çıkarın.

Şimdi pens kullanarak sekumun tamamını rezeke edin. Sekumu paslanmaz çelik havanda tutun ve ardından diseksiyon makası ile sekumun her iki ucunu kesin. Bir P 1000 pipet ucunu bir mililitre sequel flush eight tamponu ile doldurun ve ardından ucu sekumun proksimal ucuna yerleştirin.

Sekel flush eight tamponunu ve sekel lümen içeriğini paslanmaz çelik havana aktarın. Şimdi sekel flush eight içeriğini steril bir havan eli ile ezin.

Ardından, bir kaba kuru buz üzerine etanol dökün ve 50 mililitrelik bir polipropilen konik tüpü kuru buz etanol banyosuna yerleştirin. Öğütülmüş dondurulmuş sekum lümen içeriğini konik tüpe aktarın ve tüpü -80 °C'de saklayın. Prosedürün bundan sonraki adımları, işlemin en zor kısımlarıdır.

MI sekumundan elde edilen materyallerin karmaşık doğası nedeniyle, kabul edilebilir bir homojenlik ve bütünlük sağlamak için tekrarlanan soğuk filoform ekstraksiyonları kesinlikle gereklidir; sulu ve organik fazlar arasındaki geniş ara yüz ortadan kaldırılmadan önce üç ila beş ekstraksiyon gerekebilir. Bir birim asit fenol kloroformu 50 mililitrelik bir Oak Ridge santrifüj tüpüne aktarın. Kapağı sıkıca kapatın ve ardından tüpü 65 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.

Bir 50 milliliter polipropilen konik tüpe yarım hacim lizis tamponu koyun ve ardından tamponu beş dakika boyunca kaynatın. -80 degrees Celsius depolama alanından çıkarılan sequel luminal içeriklerini, tüpü elinizle hızlıca ovarak kısa süreliğine ısıtın ve ardından kaynayan lizis tamponunu tüpe ekleyin. Lizis tamponunun SQL luminal içerik çözeltisini homojenize etmek için karışımı çalkalayın.

Lizis tamponunu ve SQL luminal içeriğini beş dakika boyunca kaynatın. Periyodik vorteksleme yaparak, fenol kloroform çözeltisini içeren Oak Ridge santrifüj tüpünün kapağını açın ve SQL içerikli lizis örneğini tüpe aktarın. Ardından kapağı Parafilm ile yeniden kapatın ve tüpü, her iki dakikada bir çalkalayarak 65 °C'lik su banyosunda 10 dakika boyunca bekletin.

Numuneyi 4 °C'de 15 dakika boyunca 2.500 ×g'de yıkayın. Ardından, beyaz ara yüzeye temas etmemeye dikkat ederek sulu fazı dikkatlice yeni bir 50 ml Oak Ridge santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra yeni tüpe eşit hacimde asit fenol kloroform ekleyin.

Kapağı parafilm ile sızdırmaz hale getirin ve tüpü yüksek hızda vorteksleyerek içeriği iyice karıştırın. Örneği santrifüj etmeye ve sulu fazı santrifüj tüpüne aktarmaya devam edin. Üstteki sulu fazın hacmi çok küçülürse, daha küçük çaplı bir tüpe aktarılabilir.

Sulu ve organik fazlar arasında görünür beyaz bir ara yüz kalmayana kadar bu işleme devam edin. Beyaz ara yüz kaybolduğunda, sulu fazı dikkatlice yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından tüpe eşit hacimde kloroform, izoamil alkol ekleyin, kapağı kapatın ve içeriği vorteksleyerek iyice karıştırın.

Ardından, örneği tekrar santrifüj ettikten sonra sulu fazı 15 milliliter polipropilen konik tüpe aktarın ve eşit hacimde isopropanol ekleyin. Daha sonra çözeltiyi en az iki saat veya gece boyunca -20 °C'de inkübe edin. Örneği inkübe ettikten sonra tüpü 45 dakika boyunca santrifüjleyin.

Tüpün altındaki jel benzeri pelet belirlendikten sonra süpernatanı uzaklaştırın. Şimdi, tüpü vorteksleyerek peleti bir mililitre buz gibi soğuk, %70 etanol ile yıkayın ve ardından numuneyi dört santigrat derecede beş dakika boyunca 10.000 ×g hızında santrifüjleyin. Son olarak, süpernatanı uzaklaştırın ve peletin oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava ile kurumasını sağlamak için tüpü ters çevirin.

Ardından RNA peletini 200 µL RNase içermeyen suda yeniden süspande edin. İlk olarak, mikro santrifüj tüpüne 20 µL 10x Turbo DNA tamponu ve 2 µL Turbo DNase ekleyip çözeltiyi nazikçe karıştırın. Daha sonra tüpü 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin ve ardından tüpe 20 µL yeniden süspande edilmiş DNA inaktivasyon reaktifi ekleyip iyice karıştırın.

Şimdi tüpü, ara ara karıştırarak oda sıcaklığında beş dakika daha inkübe edin. Ardından, peleti bir mikro santrifüjde 10,000 ×g hızında 1,5 dakika boyunca çöktürün ve ardından süpernatanı yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Pelete bir hacim soğuk asit fenol kloroform ekleyin ve ardından çözeltiyi bir dakika boyunca vorteksleyerek iyice karıştırın.

Çözeltiyi 12,500 ×g'de iki dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, sulu fazı yeni bir tüpe aktarın ve bir hacim kloroform izoamil alkol ekleyin. Ardından, çözeltiyi aynı koşullar altında tekrar santrifüj ettikten sonra vorteksleyerek karıştırın. Sulu fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Ardından, 0,1 hacim üç molar sodyum asetat ve 2,5 hacim buz gibi soğuk %100 etanol ekleyin. Karıştırmak için tüpü vorteksleyin. Örneği -80 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, 4 °C'de 30 dakika boyunca 12,000 ×g'de santrifüj ettikten sonra süpernatantı uzaklaştırın. Son olarak, peleti 1 ml buz gibi soğuk %70 etanol ile yıkayın. Süpernatantı uzaklaştırın ve peleti 10 dakika boyunca havada kurutun.

Ardından pellet'i 100 µL RNase içermeyen su içerisinde yeniden süspande edin. Agilent Bioanalyzer; DNA, RNA, protein ve hücrelerin boyutlandırılması, miktar tayini ve kalite kontrolü için kullanılan mikroakışkan tabanlı bir platformdur ve RNA bütünlük numarası veya RIN olarak bilinen bir RNA bütünlük metriği kullanır. Bu protokol ile ekstrakte edilen örnekler, 1,7 ile 2,0 arasında değişen 260/280 oranları ve 7,0'a eşit veya daha büyük RIN değerleri üretir.

Bakteriyel RNA'ya ait bir Agilent bioanalyzer elektroferogram örneği burada solda, fare SQL içeriklerinden geri kazanılan pseudomonas arosa'nın jel benzeri görüntüsü ise burada sağda gösterilmiştir. Bu prosedürün ardından, rafine gen ekspresyon profillemesi gibi ek soruları yanıtlamak için kantitatif PCR veya RNA sekanslama gibi diğer yöntemler uygulanabilir.