Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

Bu protokolün genel amacı; in vivo ortamda nötrofil kemoatraktanlarına yanıt olarak gelişen nötrofil göçü sırasında, dinamik nötrofil-endotelyal hücre etkileşimlerini incelemek için parlak alan, intravital mikroskobik ve zaman ayarlı video fotoğrafçılığını kullanmaktır. Bu videoda, farelerin kama kası dokusunda nötrofillerin lüminal sürünme, endotelyal göç ve kemotaksisini görselleştirmek ve belirlemek için parlak alan intravital video mikroskobisinin nasıl kullanılacağına dair prosedürleri gösteriyoruz. Lökosit göçü, inflamasyonun temel özelliğidir.

Bu hücre toplama süreci, kan dolaşımındaki lökositlerin inflamasyon bölgesindeki post kapiller damarların endoteliumu üzerinde yuvarlanmaya başlamasıyla başlar. Vasküler yüzeydeki kemokinlere veya diğer kemoatraktanlara yanıt olarak, bu yuvarlanan lökositler endotelium üzerinde durur ve buraya sıkıca yapışır. Adhezyonun ardından birçok lökosit lüminal yüzeyde ilerleyerek optimal bir transmigrasyon bölgesi arıyor gibi görünür.

Sürünme işlemini takiben lökositler endotel üzerinden hareket eder; bu sürece T endotel göçü denir. Ardından nötrofiller, inflamasyon bölgesindeki kemoatraktan kaynağına doğru damar dışı dokuda göç ederler, bu sürece kemotaksis MOI'leri adı verilir. Bu video, nötrofil intralüminal sürünmesini, T endotel göçünü ve Oma kas dokusundaki kemotaksis göçünü ve nötrofil kemoatraktan kaynağına verilen yanıtı görselleştirmek, izlemek ve belirlemek için parlak alan intravital videonun, mikroskopik zaman ayarlı fotoğrafçılığın ve Image J'nin nasıl kullanılacağına dair deneyi göstermektedir.

Merhaba, ben Saskatchewan Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakoloji Bölümü'nden Lis Liu. Bugün size agro jel içerisinde nötrofil kemotaktik gradyanının nasıl oluşturulacağını göstereceğiz. İntravital mikroskopi için fare kremaster kasının nasıl hazırlanacağını anlatacağız.

MEGJ kullanarak hücre hareketinin nasıl takip edileceği ve son olarak nötrofil göçü parametrelerinin nasıl analiz edileceği konusunda, laboratuvarımızdaki iki lisansüstü öğrencimiz olan ngel Naja, sh ve Chile size ayrıntılı deneysel prosedürleri gösterecekler. Merhaba, ben Naja Sh. Merhaba, ben Chile.

Bu deneye başlamak için, öncelikle nötrofil kemoatraktanı hazırlayın; bir pipet yardımıyla 50 ml'lik konik bir tüpe 10 ml iki katı (2x) PBS ekleyin. Tüpü, içinde sıcak su bulunan bir behere yerleştirerek ısıtın. 10 ml distile su pipetleyin.

Başka bir 50 mililitrelik konik tüpe 0,4 gram agar tozu ekleyin. PBS içinde %2'lik agar hazırlamak için karışımı bir mikrodalga fırında kaynama noktasına gelene kadar ısıtın. Isınmış iki katı PBS'yi agar çözeltisi tüpüne ekleyin.

Karıştırılmış çözeltiyi dairesel hareketlerle sallayın ve sıcak su beheri içerisinde sıcak tutun. Kemotaktik çekici çözeltiyi, 1,5 mililitrelik bir eppendorf tüpünün kapağında üç µL India Ink ile iyice karıştırın. Karıştırma sırasında hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.

200 µL'lik bir pipet ucunun uç kısmını kesin ve mikro pipet kullanın. 42 °C'deki agro solüsyonundan 110 µL'yi kapağa ekleyin ve hemen iyice karıştırın. Bu kemoatraktan içeren jeli, başka bir pipet ucu kullanarak kullanıma kadar buzdolabında saklayın. Yetişkin bir erkek fareyi, ksilazin ve ketamin karışımının IP enjeksiyonu ile anestezi edin.

Anestezi sonrası elektrikli tıraş makinesi ile sağ eksternal juguler venin üzerindeki bölgeyi ve skrotumun ön kısmını tıraşlayın. Anestezize edilmiş fareye özel dikkat ve özen gösterilmesi önemlidir. Farede hipotermiyi önlemek için bir ısı lambası kullanılabilir.

Fare ağrı refleksinden kurtulmuş olmalıdır. Yatay bir insizyon yapın, jugular veni bulun ve mililitre başına 100 ünite heparinli salin ile doldurulmuş bir PE 10 tüp kullanarak kateterize edin. Kremaster kasını ve farenin vücudunun geri kalanını sıcak tutmak için düzeneği 37 °C'lik bir su sirkülatörüne bağlayın.

Farelerin arka bacaklarını, sırt üstü yattıkları şekilde göbek bağlama şeritleri ile kremaster kası tahtasına sabitleyin. Sol kremaster kasını açığa çıkarmak için skrotal deride bir insizyon yapın. Kası, ilişkili fasya ile bağlantılı olduğu yerden dikkatlice diseke edin.

Kremaster kasını 37 °C'ye ısıtılmış bikarbonat tamponlu salin ile süper fize edin. Kremaster kasını, kremaster kası tahtasının şeffaf izleme camı kaidesine sabitlemek için distal ucuna 4.0 dikiş atın. Kremaster kasını, dört sıfır dikiş içeren bir koter ile boylamsal olarak koterize edin.

Kası düz tutun ve kaidenin kenarları boyunca sabitleyin. Testis ve epididimisi alttaki kastan ayırın ve bunları karın boşluğuna taşıyın. 22 by 22 milimetrelik bir cam lamelin zıt kenarlarına ince bir tabaka vakum gresi sürün.

Ardından, açığa çıkan kasın üzerini lamelle örtün. Ana kas tahtasını mikroskop tablasına yerleştirin. Kası mikroskop altında inceleyin ve uygun bir postkapiller ven bulun.

Normal kayma hızına ve 25 ile 40 mikrometre arasında bir çap değerine sahip olan venülü seçin. Venülün, TV monitörünün sağ veya sol ucunda dikey konumda görüntülenebilmesi için video kamerasını ayarlayın. 30 dakika sonra, seçilen postkapiller venülün video görüntülerini, DVD kaydedici gibi bir video kayıt cihazı kullanarak bazal kontrol verileri olarak kaydedin.

Bunlar, post kapiller venün bazal kontrol video görüntüleridir. Kremasker kasının yüzeyine kemoatraktan içeren jeli yerleştirmeden önce, superfüzyonu durdurun ve cam kapatma lamelini kaldırın; eppendorf tüpünün kapağından bir kübik milimetre boyutunda kemoatraktan içeren jel punchlayın. Ucu kesilmiş bir 200 µL pipet ucu kullanarak, punchlanmış kemoatraktan içeren jeli, gözlemlenen post kapiller venün 350 µm uzağındaki önceden seçilmiş bir alana, kremaster kasının yüzeyine yerleştirin.

Jeli yerinde tutmak için bir lamel ekleyin ve jelle yavaşça salınan ve oluşan bir kemoatraktan gradyanının kurulmasına izin vermek için kas dokusuna dakikada 10 µL veya daha az olacak şekilde çok düşük bir hızda süperfüzyon uygulayın. Kemoatraktan içeren jelin eklenmesinden sonra video görüntüsünü 90 dakika boyunca kaydedin. Kayıt sırasında, mikroskop odağını ven içindeki ve kas dokusundaki yapışan, sürünen, transmigre olan ve kemotaksi gösteren lökositler üzerinde ayarlayın ve tutun.

Deneyden sonra, video dosyasını bir bilgisayara aktarın. Bilgisayar üzerinde analiz yapmak için videoyu ayıklayın ve AVI formatına dönüştürün. Örneğin, DVD videoyu bir AVI dosyasına dönüştürmek için ücretsiz bir bilgisayar yazılımı olan bit ripper'ı kullanın.

Orijinal gerçek zamanlı videodan bir hızlandırılmış çekim (time-lapse) filmi oluşturmak için Windows Movie Maker gibi bir video düzenleme yazılımı kullanın ve hızlandırılmış çekim filmini DV A VI formatına dönüştürerek kaydedin. Kalibrasyon mikrometresinin görüntülerini aynı mikroskop ayarları altında kaydedin. Görüntüleri bilgisayara aktarın.

Görüntüleri ImageJ ile açın. Ekran boyutunu hem x hem de Y eksenlerinde ölçün ve mikrometre başına piksel sayısını hesaplayın. Filmi içe aktarmak için ImageJ'i açın. Tekrar, QuickTime movies eklentisini kullanarak dosya içe aktar (file import) seçeneğine tıklayın, analiz edilecek filmi seçin ve QT film açıcı arayüzünde tamam'a tıklayın, eklentilere (plugins) tıklayın. Hücreleri takip etmek için Manuel Takip (Manual tracking) özelliğini kullanın; takibe başlamadan önce ekranın altındaki alanlara ilgili bilgileri girin, takip öncesinde şu parametreler belirlenmelidir: takip süresi.

Saniye cinsinden aralık, toplam zaman aşımının 30'a bölünmüş halidir; xy kalibrasyonu, mikrometre görüntüsünün kalibrasyonundan elde edilen piksel başına mikrometre ölçümüdür; Z kalibrasyonu sıfıra ayarlanmıştır; merkezleme için arama karesi boyutu bire eşittir. Kaydedilen videoda referans noktası olarak stabil ve net bir nokta seçmek gereklidir. Bu referans noktası, tüm deney boyunca değişmeden kalan ve stabil olan herhangi bir net ve küçük yapısal nokta olabilir.

Referans noktasını ilk kareden son kareye kadar takip etmek için "add track" seçeneğine tıklayın. Ardından, sürünerek göç eden nötrofillere tek tek tıklayarak onları takip edin. Hücreyi, dokuda göründüğü andan itibaren her karedeki kayboluşuna kadar takip etmek için "add track" seçeneğine tıklayın.

Ardından, işlemi tamamlamak için tıklayıp takip edin ve sonuçları Microsoft Excel'e kaydedin. Sonuç dosyasını Microsoft Excel'de açın. Verileri analiz etmeye başlayın.

Referans noktasının hareketlerini analize dahil etmek önemlidir. Nötrofil ve lüminal sürünme izleme sırasında, nötrofil ve lüminal sürünme mesafesini ve sürünme hızını belirleriz. Nötrofil transendotelyal migrasyonunu analiz ederken, nötrofil transmigrasyon süresini ve ayrılma süresini ölçeriz.

Kas dokusunda nötrofil kemotaksisini belirlerken, kas içindeki nötrofil migrasyonunun ve kemotaksisinin mesafesini ve hızını ölçeriz; ayrıca kas dokusundaki nötrofil kemotaksisi sırasında kemotaksis indeksini belirleriz. Ekranda gösterilen bu parametrelerin tanımları, yazılı protokolümüzde ayrıntılı olarak verilmiştir. Bu deneyde, nötrofillerin intralüminal sürünmesini, endotel göçünü ve kemotaksis sırasındaki migrasyonunu görselleştirmek ve belirlemek için parlak alan intravital mikroskobunun nasıl kullanılacağına dair prosedürleri gösteriyoruz.

İn vivo nötrofil kemoatraktanlarına yanıt olarak, fare CMA kas dokusunda nötrofil göçünü indüklemek için MIP-2, CXCL2 veya hazırlanan sentetik peptit W-K-Y-M-V-M içeren bir agar jel kullandık. Bu şekildeten görülebileceği üzere, 0.5 µM konsantrasyondaki MIP-2 ve 0.1 mM konsantrasyondaki W-K-Y-M-V-M, benzer hızlarda nötrofillerin intralüminal sürünmesini tetiklemiştir. Nötrofillerin transendotelyal migrasyonu ve venlerden ayrılma süreleri ise benzerlik göstermiştir.

Bu iki kemoatraktan, kas dokusunda nötrofil migrasyonunu ve kemotaksisini neredeyse aynı hızda ve benzer nötrofil kemotaksis indeksleri ile indüklemiştir. İntravital mikroskopi, nötrofil göçü sürecinin doğrudan gözlemlenmesi ve her göç basamağındaki hücre ve molekül fonksiyonlarının kantitatif olarak belirlenmesi için değerli bir araçtır. Time-lapse video fotoğrafçılığı ve Image J kullanılarak; lümen içi sürünme, endotel migrasyonu ile lökositlerin kemotaksisindeki migrasyon ve doku içi migrasyon; parlak alan intravital mikroskobu altında, seçici inhibitörler, transgenik fareler ve seçici kemoatraktanlar ile ölçülebilir.

Analiz sistemi, spesifik proteinlerin lökosit göçündeki işlevlerini ortaya çıkarmamıza yardımcı olabilir.