Epstein-Barr Virus Büyüme dönüştürülmüş lenfoblastoid hücre dizilerinde kurulması

Bu prosedürün genel amacı, insan B hücrelerinden eps. Epstein-Barr virüsü ile transforme edilmiş Lenfoblast hücre hatları veya LCL üretmektir. Bu işlem, öncelikle insan kanından periferik kan mononükleer hücrelerinin izole edilmesiyle gerçekleştirilir.

Ardından, hücreler FK 5 0 6 ve immünsupresif ajanların varlığında EP Epstein-Barr virüsü ile enfekte edilir; EP Epstein-Barr virüsü enfeksiyonundan üç ila dört gün sonra, CD 23 yüksek, CD 58 pozitif olarak işaretlenen ve proliferasyona gireceği öngörülen bir hücre alt popülasyonu ortaya çıkar. CD 23 yüksek, CD 58 pozitif hücreler, başarılı bir sonucun öngörücüsü olarak akış sitometrisi ile sayılabilir. Prolifere olan hücreler, başarılı şekilde transforme edilmiş hücre kültürlerinde oluşan lenfoblast hücre hattı kümeleri aracılığıyla mikroskobik ve makroskobik olarak daha ayrıntılı şekilde tanımlanabilir.

Son adım, kriyokoruma için lenfoblast hücre hatlarını genişletmektir. Laboratuvarımda, konakçı ile Epstein-Barr virüsü arasındaki etkileşimleri anlamak için lenfoblast hücre hatları veya LCL'ler oluşturuyoruz. Lenfoblast hücre hatları, bilim dünyası için, özellikle de virologlar, immünologlar ve kanser biyologları için geniş bir genel ilgi alanıdır.

Bir Macintosh laboratuvarında doktora sonrası araştırmacı olarak, lenfoblast hücre hatlarının oluşturulma prosedürünü göstereceğim. Bir donörden 10 mililitre kan alındıktan sonra, heparinize kanı 50 mililitrelik konik bir tüpe ekleyin ve ardından bire iki oranında seyreltin. Tüpe 20 mililitre oda sıcaklığında PBS ekleyerek, seyreltilmiş kanın altına 15 mililitre FICO HIA lenfosit ayırma ortamı yerleştirin ve ardından gradyan oluşturmak için kanı oda sıcaklığında, frenleme olmadan 30 dakika boyunca 225 ×g hızda santrifüjleyin.

Ardından, buffy coat tabakasını alın ve yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Hacmi PBS ile 50 mililitreye tamamlayın ve ardından hücreleri 600 ×g'de 10 dakika boyunca pelletleyin. Süpernatantı dökün, pelletini 50 mililitre PBS içinde tekrar süspanse edin ve ardından hücreleri aynı koşullar altında iki kez daha yıkayın.

Şimdi hücreleri bir mililitre tam RPMI içerisinde yeniden süspanse edin. Tripan mavisi ile 1/10 seyreltme yapmak ve hemositometre kullanarak canlı hücreleri saymak için beş mikrolitre hücre kullanırım, ardından hücre konsantrasyonunu mililitre başına iki çarpı altı hücreye ayarlamak için tam RPMI ile hacmi düzenlerim ve hücreleri 25 santimetrekarelik bir doku kültürü flaskına aktarırım.

Hücreleri Epstein-Barr virüsü ile enfeksiyona hazırlamak için, doku kültürü flaskına final konsantrasyonu 20 M olacak şekilde FK 5 0 6 ekleyin. Ardından flaskı, 37 °C sıcaklıktaki %5 karbondioksit inkübatörüne bir saatliğine yerleştirin. Hücrelerin inkübasyon süresi dolmak üzereyken, B 95 8 hücrelerinden hasat edilmiş bir alikot Epstein-Barr virüsünü hızla çözdürün. Daha sonra flaskı inkübatörden çıkarın ve hücrelere 1/10 dilüsyonunda EP Epstein-Barr virüsü ekleyin; ardından Epstein-Barr virüsünü çözelti içinde karıştırmak için flaskı sallayın ve kapağı kapalı şekilde (havalandırmasız flask kullanılıyorsa kapak hafifçe gevşek bırakılarak) dik konumda inkübatöre yerleştirin. Bu işlemi, kriyoprezervasyon için kültürün genişletilmesinden iki ila üç hafta önce gerçekleştirin.

eps'den (Epstein Barr virüsü enfeksiyonu) bir hafta sonra, erken mikroskobik kümeleri gösteren bu temsilci şekilde görüldüğü gibi, hücre kümeleri ışık mikroskobu ile görünür hale gelir. Zaman ilerledikçe mikroskobik kümeler büyür; öyle ki, LCL'nin daha büyük kümelerinin hücreleri beslemek için gözlemlenebildiği bu şekilde görüldüğü gibi, flask içerisinde makroskobik olarak topaklar görünür hale gelir ve 12. günde kültür flaskındaki destekleyici ortamın hacmi iki katına çıkar. Kültür ortamı, tipik olarak haftada bir kez sarıya döndüğünde, hücreleri genişletmek ve kültür hacmini iki ila üç kat artırmak için genellikle hücreleri besleme zamanı gelmiştir.

Kriyoprezervasyon için hücre üretmek amacıyla, önümüzdeki birkaç hafta boyunca tam RPMI kullanarak kültürü 75 santimetrelik kare bir flask içerisinde 70 ila 100 mililitreye genişletin; başarılı bir sonuç, bu dağılım grafiğinde görüldüğü üzere CD 23 ve yüksek CD 58 pozitif hücrelerin varlığı ile öngörülür, Epstein-Barr virüsüne maruz kaldıktan sonraki üçüncü veya dördüncü günde canlı hücrelerin yaklaşık %2 ila 3'ü bu profile sahiptir; Epstein-Barr virüsüne maruz kaldıktan sonra gözlemlenen CD 23 pozitif, CD 23 negatif, CD 58 pozitif ve CD 58 negatif hücrelerin diğer alt popülasyonları minimal proliferasyon gösterir ve enfekte olmamış hücreler veya Epstein-Barr virüsünün ölümsüzleştirici olmayan bir suşu ile enfekte olmuş hücreler yüksek CD 23 göstermez.

CD 58 pozitif hücreler. Hücreler ışık mikroskobu ile de görüntülenebilir. Belirtildiği üzere, Epstein-Barr virüsü enfeksiyonundan sonraki bir hafta içinde, flask içerisinde ışık mikroskobu ile küçük hücre kümeleri görülebilir.

Zaman ilerledikçe ve hücreler LCL'ye dönüştükçe, mikroskobik kümeler büyür ve böylece balon içerisinde makroskobik olarak görülebilen topaklar oluşur. Pekala. Bu videoyu izledikten sonra, insan kanından periferik kan mononükleer hücrelerinin nasıl izole edileceği ve insan B hücrelerinden Epstein-Barr virüsü ile transforme edilmiş lenfoblast hücre hatlarının nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız; her ne kadar lenfoblast hücre hatlarının oluşturulması diğer laboratuvarlar tarafından da tanımlanmış olsa da.

Protokolümüzün avantajı, araştırmacılara B hücrelerinin Epstein-Barr virüsü ile enfekte edilmesinden sonraki üç ila dört gün gibi erken bir sürede başarılı sonucu öngörme yöntemi sunmasıdır.