Name: Epstein-Barr Virus Büyüme dönüştürülmüş lenfoblastoid hücre dizilerinde kurulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Öğrenin Epstein-Barr virüsüyle dönüştürülmüş lenfoblastoid hücre hatları oluşturma yöntemini. İnsan B hücrelerinden izolasyon, enfeksiyon ve erken dönüşüm belirteçleriyle viroloji araştırmalarınızı hızlandırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma NIH hibe programı K08 AI062732, K12 HD001401 ve 1UL1RR024139-02 ve SB-M Charles H. Hood Vakfı Çocuk Sağlığı Eğitim ve Araştırma Burs tarafından finanse edildi. Stony Brook, New York Eyalet Üniversitesi Araştırma Vakfı tarafından.

1. EBV stok Preparation <ol><li> 75cm 2 doku kültürü şişesi steril tekniği kullanarak 3 x 5 10 hücre / ml; katlanarak büyüyen B95-8 hücreleri (13 ATCC # CRL 1612) Altkültür. Hücreler 37 0.5 mikrogram / ml tam RPMI 1640 yılında sırasıyla% 10 ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS), Penisilin / 100U/ml az Streptomisin ve 100 mcg / ml içeren yetiştirilen ve Amfoterisin B ° C varlığında % 5 CO 2. </li><li> Kırk sekiz saat sonra, 1 x 10 6 hücre / ml taze tam RPMI 1640 yılında tekrar süspansiyon hücreleri. Virüs üretim ikna etmek için, standart bir CO 2 inkübatör 1 saat 20ng/ml tetradecanoyl phorbol asetat (TPA) ve hücreleri uyarır. RPMI 1640 TPA kaldırmak için hücreleri üç kez yıkayın. </li><li> Tam RPMI 1640 orijinal hacmi (1.2) hücreleri yeniden süspanse edin ve 96 saat için CO 2 inkübatör şişesi yerleştirin. Bu yöntem, bulaşıcı bir virüs par yüksek titreleri olduğu gösterilmiştirpartikülleri 6. </li><li> 4 az 10 dakika süreyle 600 x g Santrifüj ° C hücreleri EBV içeren kültür süpernatant ayrı. Bir yıl boyunca -70 0.45 mikron filtre, kısım, ve mağaza ° C süzülür süpernatant. ATCC (VR-1492) EBV içeren B95-8 hücreleri süpernatant ATCC tarafından önerilen seyreltme elde etmek ve kullanmak için bir alternatif. </li></ol> 2. Izolasyonu periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) <ol><li> Heparinize şırınga veya heparinize kan tüpü içine vericiden alınan 10 ml kan çizin. Oda sıcaklığında 50 ml konik bir tüp içerisinde 20 ml PBS ile kan sulandırınız. </li><li> 15 ml Ficoll Hypaque lenfosit ayırma orta Underlay seyreltilmiş kan. 30 dakika oda sıcaklığında frensiz, 225 x g'de santrifüjleyin . </li><li> Yeni bir 50 ml konik tüp içine buffy coat ve transfer çıkarın. PBS ile 50 ml hacim kaldırın ve 10 dakika oda sıcaklığında 600 xg'de döndürün. </li><li> Pour süpernatant kapalı. 50 ml PBS içinde pelet resuspending ve 10 dakika oda sıcaklığında 600 x g iplik hücreleri yıkayın. Benzer bir şekilde iki kez daha yıkayın. </li><li> Süspanse edin 1 ml tam RPMI hücreler yıkanır. Tripan mavisi 1 / 10 dilüsyon hazırlamak için 5 mcL hücre kullanın. Hemasitometre kullanarak canlı hücre sayımı. </li><li> 2 x 10 6 / ml, bir hücre konsantrasyonunu elde etmek için 25 cm 2 doku kültürü şişesi tam RPMI kullanarak ses seviyesini ayarlayın. </li></ol> 3. EBV enfeksiyonu <ol><li> 2.6 20 nM son bir konsantrasyonu hücre süspansiyonu FK506 (AG Bilimsel). 37 CO 2 inkübatör Yeri balon ° C 'de bir saat. </li><li> Hızla EBV bir kısım Çözülme. Inkübatör balonun çıkarın ve 1 / 10 dilüsyon hücreleri EBV ekleyin. Tipik olarak, bu seyreltme bir İçişleri Bakanlığı 50-100 sağlar. 37 mix ve CO 2 inkübatör dik yerleştirmek Swirl balon ° C </li></ol> Not incibaşarılı bir sonuç tahmin etmek için yapılan Adım 4, isteğe bağlı bir adımdır. Adım 4 yapılacak ise, kontrol olarak 2 x 10 6 hücre / ml un-enfekte hücre ek bir balon inkübe gerekecektir. 4. Hücrelerin hızla çoğalan nüfus (Opsiyonel adımı) belirlenmesi <ol><li> FACS tampon PBS +% 5 FBS: hazırlayın. Mağaza, 4 ° C </li><li> Aşağıdaki antikor hücre boyama Adım 4.6 50 mcL hacmi her karışımları olun. Antikor dilüsyonları içeren 1mg/ml fare IgG (Sigma) antikorlarının non-spesifik bağlama inhibe FACS tampon yapılmalıdır. <ol class="lroman"><li> PE konjuge anti-CD23 antikoru (1 / 50 dilüsyon) ile tek lekeli </li><li> FITC konjuge anti-CD58 antikoru (1 / 50 dilüsyon) ile tek lekeli </li><li> PE-Cy5 konjuge anti-CD19 antikoru (1 / 50 dilüsyon) ile tek lekeli </li><li> triple-lekeli CD23, CD58 ve CD19 (1 / 50 dilüsyon her) </li><li> PE konjuge izotip kontrolü ile tek lekeliantikor CD23-PE için uygun (anti-CD23 antikoru ile aynı konsantrasyonda) </li><li> FITC konjuge izotip kontrol antikoru (anti-CD58 antikoru ile aynı konsantrasyonda), CD58-FITC uygun tek lekeli </li><li> tek lekeli PE-Cy5 konjuge izotip kontrol antikor uygun CD19-PE-Cy5 (anti-CD19 antikoru ile aynı konsantrasyonda) </li><li> Her üç izotip kontrol antikorları ile triple-boyandı. </li></ol> Geçici olarak karışımları 4 ° C'de karanlıkta saklayın. </li><li> EBV günde üç maruziyet sonrası, yavaşça girdap şişesi daha homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için. Şişeden 2ml Eppendorf tüpe 2ml çıkarın. 3000 rpm'de 3 dakika boyunca oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj tüp Spin. </li><li> 5 x 10 6 1 x 10 7 hücre / ml FACS tampon supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire edin. </li><li> Bireysel Eppendorf tüpleri içine sekiz 50μl bölüntülerin veya 96-iyi bir V-alt plaka çıkarın. Spin tüpler veya 1500 x g plaka3 dakika. </li><li> Süpernatant ve vorteks tüpler / plaka atın. Her bir tüp içinde süspanse edin hücreleri / 4.2 hazırlanan uygun antikor dilüsyonları içeren FACS tampon 50 mcL. </li><li> Tüpler / plaka, 30 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde inkübe edin. 3000 rpm'de 3 dakika Santrifüj hücreleri, süpernatant kaldırmak ve FACS tampon 200 mcL ekleyin. Hücrelerin tekrar santrifüj ve yıkama tamamlamak için süpernatant kaldırmak. Iki yıkar daha tekrarlayın. </li><li> 200 mcL FACS yeniden süspanse hücreler 20.000 olaylar / tüp elde bir akış sitometresinin kullanarak veri tampon ve kazanır. </li><li> WinMDI (PC FACS veri analizi için ücretsiz) kullanarak verileri analiz edin. Ileri ve yan dağılım profilleri kullanarak canlı hücreler üzerinde Kapısı. Daha sonra, canlı hücreleri CD19 + (B hücre belirteci), anti-CD19 antikoru uygun izotip kontrol antikoru ile boyanan hücreler ile karşılaştırırken sonra ifade için kapı . Arsa CD19 + canlı B hücreleri CD23 floresan ile y ekseni üzerinde x-ekseni ve CD58 için floresan. Belirleyin CD23 + ve CD58 + EBV maruz kalan hücrelerin eşleşen izotip kontrol antikorları ile boyandı karşılaştırarak hücreler. EBV maruz kalan kültür CD23 yüksek CD58 + hücreler (Şekil 2C) varlığı, EBV ile infekte büyüme transforme hücreler başarılı bir akıbet öngörüyor. Hücrelerinin EBV (Şekil 2A) maruz kalan ya da EBV (Şekil 2B) olmayan bir immortalizing zorlamalara maruz değildir aksine, CD23 yüksek CD58 + hücreler ortaya yoktur. CD23 yüksek CD58 + hücrelerin çoğalması tabi deneysel olarak gösterilmiş ve daha sonra LCL (14) kurulması olmuştur. </li></ol> 5. LCL genişletilmesi ve kriyoprezervasyon <ol><li> Işık mikroskobu ile hücrelerin Görselleştirme: EBV enfeksiyonundan bir hafta sonra, hücre kümeleri, ışık mikroskobu ile görülebilir. Şekil 3 balonuna erken mikroskobik kümeler (Şekil 3B) bir örnek gösterir. </li><li> Zaman ilerledikçe, mikroskobik kümeler, büyük, yığınlarda görünür halemakroskobik balondaki. Şekil 3C, ışık mikroskobu ile kurulan LCL hücrelerin daha büyük kümeler gösterir. </li><li> Hücreleri Besleme: 12 günlük kültür şişelerinde kültür ortamı hacmi ikiye katlayın. Daha sonra, tam RPMI kullanarak hacmi 2-3 kat artmaktadır kültür genişletin. </li><li> Besleyen hücreleri periyodikliği hücre büyüme oranı esas alınarak tespit edilmelidir. Kültür ortamı, sarı yandığında, genellikle yukarıdaki gibi medya değiştirme zamanı. Genellikle, haftada bir kere ortaya çıkar. Ancak, bazı hücre hatları daha fazla veya daha az sık sık beslenen gerekebilir. Önümüzdeki birkaç hafta içinde 75-100 ml kültür genişletin. </li><li> Kriyoprezervasyon hücreleri aşağı dondurma, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 600 x g santrifüj hücreleri. 1 x 10 7 hücre / ml 'de% 90 FBS içeren soğuk dondurucu orta ve% 10 dimethylsülfoksit supernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın. Sıvı azot tüpü yerleştirin. </li></ol> 6. Temsilcisi sonuçları: CD23 yüksek CD58 + hücrelerin varlığı ile başarılı bir sonuç tahmin ediliyor. Bu profili (Şekil 2C) EBV maruz kaldıktan sonra 3-4 gün canlı hücrelerin yaklaşık% 2-3 olmalıdır. Diğer CD23 alt-popülasyonları +, CD23 -, CD58 + ve CD58 hücreler EBV maruz kaldıktan sonra en az 14 çoğalması göstermek gözlenmektedir. EBV olmayan bir immortalizing gerginlik barındıran HH514-16 hücreleri (Şekil 2B), EBV maruz Un-enfekte olmuş hücreleri (Şekil 2A) ve hücreler CD23 yüksek CD58 + hücreler olduğunu göstermez. Bir hafta içinde, Daha önce de belirtildiği gibi EBV enfeksiyonu sonrası, balon hücrelerin küçük kümeler tarafından görülebilir ışık mikroskobu (Şekil 3B): Aynı zamanda başarılı bir sonuç izlemek için ışık mikroskobu ile hücrelerin görselleştirmek olabilir. Zaman ilerledikçe ve hücreleri LCL geliştikçe, mikroskobik kümeler kümeleri balon makroskopik olarak görünür olduğundan (3C Şekil) daha büyük olur. Şekil 1 lenfoblastoid hücre hatları üretimi ve dondurulması için iş akışı. Periferik kan bir Ficoll degrade ile santrifüj edilir. Kurulmuş bir degrade buffy coat PBMC mevcut EBV ilavesi ile takip FK506 maruz kalmaktadır. EBV maruz kalan hücreleri 37 ° C daha sonra dondurulması için LCL kurmak ve genişletmek için 5% CO 2 varlığında yetiştirilmektedir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig2.jpg"> Şekil 2 B hücreleri EBV maruz kaldıktan sonra yayılması geçmesi beklenen bir alt nüfusun belirlenmesi . Un-enfekte hücre (A) veya hücre HH514-16 hücreleri (B) veya B95-8 FK506 varlığı hücreleri (C) elde edilen EBV maruz 3. günde hasat edildi. Hücreler, CD19, CD23 ve CD58 yöneltilen florokrom-konjuge antikor ile boyandı. Yolluk sonra canlı hücres, un-enfekte (A) ve EBV maruz kalan (B ve C) CD19 + B hücreleri CD23 ve CD58 ekspresyonu incelendi. B hücreleri CD23, CD58 ve yüksek düzeyde (CD23 yüksek CD58 +), ifade bir alt nüfus tasvir, sadece dönüşüm yetkin EBV (B95-8 hücreleri elde) maruz kalan hücrelerde gözlemlemiştir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig3.jpg"> Şekil 3 EBV ile enfekte hücrelerde hücre kümeleri Görselleştirme. PBMC FK506 ile tedavi edilen ve EBV ile enfekte edildi. Un-enfekte (A) ve EBV maruz kalan (B) hücrelerin faz kontrast mikroskobu (10X büyütme) bir hafta sonrası enfeksiyon incelendi. Beş haftalık lenfoblastoid hücre hattı C ile gösterilir

<ol><li>Thorley-Lawson, D. A., Gross, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+the+Epstein-Barr+virus+and+the+origins+of+associated+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Persistence of the Epstein-Barr virus and the origins of associated lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 350, 1328-1337 (2004).</li>
<li>Kubuschok, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+spontaneous+Epstein-Barr+virus+lymphoblastoid+cell+lines+genetically+modified+to+express+tumor+antigen+as+cancer+vaccines%3A+mutated+p21+ras+oncogene+in+pancreatic+carcinoma+as+a+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Use of spontaneous Epstein-Barr virus lymphoblastoid cell lines genetically modified to express tumor antigen as cancer vaccines: mutated p21 ras oncogene in pancreatic carcinoma as a model.</a> Hum. Gene Ther. 13, 815-827 (2002).</li>
<li>Kuppers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+under+influence%3A+transformation+of+B+cells+by+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 801-812 (2003).</li>
<li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells%3A+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat. Med. 10, 871-875 (2004).</li>
<li>Bernasconi, N., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+serological+memory+by+polyclonal+activation+of+human+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells.</a> Science. 298, 2199-2202 (2002).</li>
<li>Oh, H. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+the+rapid+establishment+of+Epstein-Barr+virus+immortalization+of+human+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes.</a> Cell Prolif. 36, 191-197 (2003).</li>
<li>Ventura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+simple+method+for+the+Epstein-Barr+virus+transformation+of+lymphocytes+from+members+of+large+families+of+Reunion+Island%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Hered%22%5BJournal%5D)">Use of a simple method for the Epstein-Barr virus transformation of lymphocytes from members of large families of Reunion Island.</a> Hum. Hered. 38, 36-43 (1988).</li>
<li>Henderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+transformation+of+lymphocytes+by+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Efficiency of transformation of lymphocytes by Epstein-Barr virus.</a> Virology. 76, 152-163 (1977).</li>
<li>Bird, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+Epstein-Barr+virus+activation+of+human+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Characteristics of Epstein-Barr virus activation of human B lymphocytes.</a> J. Exp. Med. 154, 832-839 (1981).</li>
<li>Neitzel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+routine+method+for+the+establishment+of+permanent+growing+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">A routine method for the establishment of permanent growing lymphoblastoid cell lines.</a> Hum. Genet. 73, 320-326 (1986).</li>
<li>Pelloquin, F., Lamelin, J. P., Lenoir, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+lymphocytes+immortalization+by+Epstein-Barr+virus+in+the+presence+of+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Human B lymphocytes immortalization by Epstein-Barr virus in the presence of cyclosporin A.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. 22, 689-694 (1986).</li>
<li>Pressman, S., Rotter, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+transformation+of+cryopreserved+lymphocytes%3A+prolonged+experience+with+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes: prolonged experience with technique.</a> Am. J. Hum. Genet. 49, 467-467 (1991).</li>
<li>Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus%3A+Transformation%2C+cytopathic+changes%2C+and+viral+antigens+in+squirrel+monkey+and+marmoset+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus: Transformation, cytopathic changes, and viral antigens in squirrel monkey and marmoset leukocytes.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 383-387 (1972).</li>
<li>Megyola, C., Ye, J., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+sub-population+of+B+cells+that+proliferates+after+infection+with+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">Identification of a sub-population of B cells that proliferates after infection with Epstein-Barr virus.</a> Virol. J. 8, 84-84 (2011).</li>
<li>Tosato, G., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-immortalized+B+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of Epstein-Barr virus (EBV)-immortalized B cell lines.</a> Current Protocols of Immunology. Chapter 7, 22-22 (1991).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu makalede açıklanan yöntemi hızlı ölümsüzleşme ve kriyoprezervasyon kez vericinin periferik kan LCL üretir. FK506 kullanımı sayesinde, T immünosupresan hücre ve bulaşıcı virüsün yüksek titreleri periferik kan mononükleer hücrelerinin EBV ile enfekte B hücrelerinin yayılması teşvik etmek mümkün. Bu müdahaleler, daha sonraki deneyler için hücreleri hızlı bir şekilde genişlemesi sonucunda açıklanan yöntem daha verimli olun. Geleneksel olarak, büyüme dönüşümü maruz kaldıktan sonra yaklaşık bir hafta EBV 6, 15 ışık mikroskobu ile hücre kümeleri görselleştirme tarafından izlenir olmuştur. Ancak, hücre kümelenme EBV-aracılı büyüme dönüşüm belirli bir göstergesi değildir. Daha önce, üç gün kıç, en erken zamanda başarılı sonucunu belirlemek için doğru bir ve belirli bir yöntem sağlayan, flow sitometri 14 ile proliferatif hücre popülasyonu tutarlı bir kimlik gösterdiB hücrelerinin EBV er maruz kalma.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Amfoterisin B </td><td> Fisher Bioreagents </td><td> BP 928-250 </td></tr><tr><td> Dimethylsülfoksit </td><td> Sigma </td><td> D 2650 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu, ısı ile inaktive </td><td> Sigma </td><td> F 4135 </td></tr><tr><td> Ficoll Hypaque lenfosit ayrılması medya </td><td> Mediatech </td><td> 25-072 </td></tr><tr><td> FK506 </td><td> AG Bilimsel </td><td> F 1030 </td></tr><tr><td> Fare serumu ile IgG </td><td> Sigma </td><td> Ben 8765 </td></tr><tr><td> PE konjuge fare anti-insan CD23 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555711 </td></tr><tr><td> PE konjuge Fare izotip IgG1 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554680 </td></tr><tr><td> FITC için konjuge fare anti-insan CD58 </td><td> Pierce Thermo SCientific </td><td> MA1-82.159 </td></tr><tr><td> FITC için konjuge Fare izotip IgG1 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550616 </td></tr><tr><td> PE-Cy5 konjuge fare anti-insan CD19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555414 </td></tr><tr><td> PE-Cy5 konjuge Fare izotip IgG1 </td><td> Dako </td><td> X 0955 </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 medya </td><td> Sigma </td><td> R 8758 </td></tr><tr><td> Tetradecanoyl phorbol asetat (TPA) </td><td> Calbiochem </td><td> 407952 </td></tr><tr><td> FACS Tampon (1X Fosfat Tamponlu Salin +% 5 fetal sığır serumu) </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

epstein-barr virus büyüme dönüştürülmüş lenfoblastoid hücre dizilerinde kurulması

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

B hücreleri Epstein-Barr virüsü (EBV) enfeksiyonu lenfoblastoid hücre hatları in vitro (LCL) kurulması ile sonuçlanan, proliferasyonu ve daha sonraki ölümsüzleşme yol açar . LCL latent EBV ile enfekte olduğundan, onlar EBV gecikme ve virüs kaynaklı B hücre proliferasyonu ve tümörogenez 1 araştırmak için bir model sistem sağlar. LCL immünolojik testleri 2, 3 çeşitli antijenleri için kullanılır olmuştur. Buna ek olarak, LCL, insan monoklonal antikorlar 4, 5 birincil biyolojik materyallere erişim 6, 7 sınırlı bir potansiyel olarak sınırsız bir kaynak oluşturmak ve sağlamak için kullanılabilir. LCL oluşturmak için çeşitli yöntemler tarif edilmiştir. Önceki yöntemleri fitohemaglütininle, lipopolisakkarid 8 mitojenler kullanımı dahil ve EBV-aracılı ölümsüzleşme verimliliğini artırmak için mitojenle 9 pokeweed. Daha yakın zamanlarda, diğerleri immunosuppr kullanılansiklosporin gibi essive ajanlar, enfekte B hücrelerinin 7, 10-12 T hücre-aracılı öldürme inhibe . EBV enfeksiyonu hücre hatlarının kurulması için zaman önemli uzunluğu sürücüler EBV-odaklı B hücre büyümesini dönüşüm için daha hızlı ve daha güvenilir yöntemleri için gereklilik. Yüksek titrede EBV ve immünsupresif ajan bir arada kullanarak, sürekli olarak, enfekte, dönüşümü, ve periferik kan B hücreleri LCL oluşturmak mümkün. Bu yöntem, hücrelerin in vitro kümeler bulaşmış periferik kan mononükleer hücreler küçük bir miktar ortaya konabilir kullanır . FK506, immünosupresan bir T hücre varlığı ile EBV CD23 varlığı. Geleneksel olarak, prolifere olan B hücreleri akıbet EBV enfeksiyonu sonrası yaklaşık bir hafta hücrelerin mikroskobik kümeler görselleştirme tarafından izlenir. LCL kümeleri birkaç hafta sonra çıplak gözle görülebilir. Belirlemek için bir test tarif eğer erken EBV-aracılı growth dönüşüm mikroskobik hücre kümeleri ortaya konabilir önce bile başarılı olur. CD23, varlığı yüksek CD58 + hücreleri gözlenen en erken üç gün sonrası enfeksiyon başarılı bir sonuç gösterir.

Epstein-Barr virüsü ile transforme B hücre hatları üretmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, üç gün sonra enfeksiyon gibi erken olarak dönüşüm geçirmesi mukadder B hücreleri belirleyebilir bir roman tahlil göstermektedir.

Epstein-Barr Virus Büyüme dönüştürülmüş lenfoblastoid hücre dizilerinde kurulması

B hücrelerinin Epstein-Barr virüsü (EBV) ile enfekte olması, proliferasyona ve ardından ölümsüzleşmeye yol açarak lenfoblastoid hatların kurulmasıyla sonuçlanır...

Bu prosedürün genel amacı, insan B hücrelerinden eps. Epstein-Barr virüsü ile transforme edilmiş Lenfoblast hücre hatları veya LCL üretmektir. Bu işlem, öncelikle insan kanından periferik kan mononükleer hücrelerinin izole edilmesiyle gerçekleştirilir.Ardından, hücreler FK 5 0 6 ve immünsupresif ajanların varlığında EP Epstein-Barr virüsü ile enfekte edilir; EP Epstein-Barr virüsü enfeksiyonundan üç ila dört gün sonra, CD 23 yüksek, CD 58 pozitif olarak işaretlenen ve proliferasyona gireceği öngörülen bir hücre alt popülasyonu ortaya çıkar. CD 23 yüksek, CD 58 pozitif hücreler, başarılı bir sonucun öngörücüsü olarak akış sitometrisi ile sayılabilir. Prolifere olan hücreler, başarılı şekilde transforme edilmiş hücre kültürlerinde oluşan lenfoblast hücre hattı kümeleri aracılığıyla mikroskobik ve makroskobik olarak daha ayrıntılı şekilde tanımlanabilir.Son adım, kriyokoruma için lenfoblast hücre hatlarını genişletmektir. Laboratuvarımda, konakçı ile Epstein-Barr virüsü arasındaki etkileşimleri anlamak için lenfoblast hücre hatları veya LCL'ler oluşturuyoruz. Lenfoblast hücre hatları, bilim dünyası için, özellikle de virologlar, immünologlar ve kanser biyologları için geniş bir genel ilgi alanıdır.Bir Macintosh laboratuvarında doktora sonrası araştırmacı olarak, lenfoblast hücre hatlarının oluşturulma prosedürünü göstereceğim. Bir donörden 10 mililitre kan alındıktan sonra, heparinize kanı 50 mililitrelik konik bir tüpe ekleyin ve ardından bire iki oranında seyreltin. Tüpe 20 mililitre oda sıcaklığında PBS ekleyerek, seyreltilmiş kanın altına 15 mililitre FICO HIA lenfosit ayırma ortamı yerleştirin ve ardından gradyan oluşturmak için kanı oda sıcaklığında, frenleme olmadan 30 dakika boyunca 225 ×g hızda santrifüjleyin.Ardından, buffy coat tabakasını alın ve yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Hacmi PBS ile 50 mililitreye tamamlayın ve ardından hücreleri 600 ×g'de 10 dakika boyunca pelletleyin. Süpernatantı dökün, pelletini 50 mililitre PBS içinde tekrar süspanse edin ve ardından hücreleri aynı koşullar altında iki kez daha yıkayın.Şimdi hücreleri bir mililitre tam RPMI içerisinde yeniden süspanse edin. Tripan mavisi ile 1/10 seyreltme yapmak ve hemositometre kullanarak canlı hücreleri saymak için beş mikrolitre hücre kullanırım, ardından hücre konsantrasyonunu mililitre başına iki çarpı altı hücreye ayarlamak için tam RPMI ile hacmi düzenlerim ve hücreleri 25 santimetrekarelik bir doku kültürü flaskına aktarırım.Hücreleri Epstein-Barr virüsü ile enfeksiyona hazırlamak için, doku kültürü flaskına final konsantrasyonu 20 M olacak şekilde FK 5 0 6 ekleyin. Ardından flaskı, 37 °C sıcaklıktaki %5 karbondioksit inkübatörüne bir saatliğine yerleştirin. Hücrelerin inkübasyon süresi dolmak üzereyken, B 95 8 hücrelerinden hasat edilmiş bir alikot Epstein-Barr virüsünü hızla çözdürün. Daha sonra flaskı inkübatörden çıkarın ve hücrelere 1/10 dilüsyonunda EP Epstein-Barr virüsü ekleyin; ardından Epstein-Barr virüsünü çözelti içinde karıştırmak için flaskı sallayın ve kapağı kapalı şekilde (havalandırmasız flask kullanılıyorsa kapak hafifçe gevşek bırakılarak) dik konumda inkübatöre yerleştirin. Bu işlemi, kriyoprezervasyon için kültürün genişletilmesinden iki ila üç hafta önce gerçekleştirin.eps'den (Epstein Barr virüsü enfeksiyonu) bir hafta sonra, erken mikroskobik kümeleri gösteren bu temsilci şekilde görüldüğü gibi, hücre kümeleri ışık mikroskobu ile görünür hale gelir. Zaman ilerledikçe mikroskobik kümeler büyür; öyle ki, LCL'nin daha büyük kümelerinin hücreleri beslemek için gözlemlenebildiği bu şekilde görüldüğü gibi, flask içerisinde makroskobik olarak topaklar görünür hale gelir ve 12. günde kültür flaskındaki destekleyici ortamın hacmi iki katına çıkar. Kültür ortamı, tipik olarak haftada bir kez sarıya döndüğünde, hücreleri genişletmek ve kültür hacmini iki ila üç kat artırmak için genellikle hücreleri besleme zamanı gelmiştir.Kriyoprezervasyon için hücre üretmek amacıyla, önümüzdeki birkaç hafta boyunca tam RPMI kullanarak kültürü 75 santimetrelik kare bir flask içerisinde 70 ila 100 mililitreye genişletin; başarılı bir sonuç, bu dağılım grafiğinde görüldüğü üzere CD 23 ve yüksek CD 58 pozitif hücrelerin varlığı ile öngörülür, Epstein-Barr virüsüne maruz kaldıktan sonraki üçüncü veya dördüncü günde canlı hücrelerin yaklaşık %2 ila 3'ü bu profile sahiptir; Epstein-Barr virüsüne maruz kaldıktan sonra gözlemlenen CD 23 pozitif, CD 23 negatif, CD 58 pozitif ve CD 58 negatif hücrelerin diğer alt popülasyonları minimal proliferasyon gösterir ve enfekte olmamış hücreler veya Epstein-Barr virüsünün ölümsüzleştirici olmayan bir suşu ile enfekte olmuş hücreler yüksek CD 23 göstermez.CD 58 pozitif hücreler. Hücreler ışık mikroskobu ile de görüntülenebilir. Belirtildiği üzere, Epstein-Barr virüsü enfeksiyonundan sonraki bir hafta içinde, flask içerisinde ışık mikroskobu ile küçük hücre kümeleri görülebilir.Zaman ilerledikçe ve hücreler LCL'ye dönüştükçe, mikroskobik kümeler büyür ve böylece balon içerisinde makroskobik olarak görülebilen topaklar oluşur. Pekala. Bu videoyu izledikten sonra, insan kanından periferik kan mononükleer hücrelerinin nasıl izole edileceği ve insan B hücrelerinden Epstein-Barr virüsü ile transforme edilmiş lenfoblast hücre hatlarının nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız; her ne kadar lenfoblast hücre hatlarının oluşturulması diğer laboratuvarlar tarafından da tanımlanmış olsa da.Protokolümüzün avantajı, araştırmacılara B hücrelerinin Epstein-Barr virüsü ile enfekte edilmesinden sonraki üç ila dört gün gibi erken bir sürede başarılı sonucu öngörme yöntemi sunmasıdır.

establishment-epstein-barr-virus-growth-transformed-lymphoblastoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Üretimi için hızlı, basit ve maliyet-etkin bir protokol, CMV, İlan EBV enfeksiyonları yakalanma riski altında allojeneik hematopoietik kök hücre nakli (HSCT) alıcıları infüzyon için donör kaynaklı multivirus spesifik CTL (rCTL). Bu üretim sürecine GMP uyumlu ve T-hücre immünoterapi uzmanlaşmış merkezlerde ötesinde daha geniş bir şekilde uygulanmasını sağlamak olmalıdır.

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Burada ilk iyi üretim uygulamaları (GMP) uyumlu göbek kordon kanı, ağırlıklı naif T hücrelerinin kaynağı virüs-spesifik sitotoksik T lenfositler (CTL) üretme yöntemi açıklar.

Kordon Kanı adlı Sitotoksik T lenfositler genişletilmesi olduğunu Hedef Sitomegalovirüs, Epstein-Barr Virus ve Adenovirüs

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

Kaposi sarkomu (KS) enfeksiyon oncogenic virüs insan herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV) ile indüklenen bir tümördür. Burada açıklanan endotel hücre kültür model benzersiz olarak hangi konak hücreleri KSHV dönüşümleri mekanizmaları eğitim için uygundur.

Hücresel dönüştürme Kaposi sarkomu Herpesvirus tarafından eğitim için bir Vitro modeli

B-LCLs'in kurulması için basit bir kırmızı kan hücre parçalama yöntemi kan küçük bir miktar gerektiren ve dondurarak saklama için başlangıcından itibaren zaman tasarrufu, yüksek ölümsüzleşme verimliliği ile geliştirilmiştir.

B lenfoblastoid hücre dizilerinde Kurulması için Basit Kırmızı Kan Hücresi Lizis Yöntemi

NK ve T Hücre klonlar CAEBV hastalardan elde etmek için basit bir yöntem yüksek verimlilik, periferik kan küçük bir miktar ve düşük doz IL-2 ile geliştirilmiştir.

NK ve kronik aktif Epstein - Barr virüsü enfeksiyonu olan hastalarda T hücre satırlarından kurmak için etkili ve basit bir yöntem

Burada Epstein Barr Virüs ölümsüzleştirilmiş insan B-lenfositler ve miyotubes içine farklılaştırılmış kas biyopsisi türetilmiş uydu hücreleri endojen olarak ifade edilen RYR1 mutasyonlarının fonksiyonel etkisini incelemek için kullanılan yöntemler açıklanmıştır.

Endojen Olarak İfade Edilen İnsan RYR1 Varyantlarının İşlevsel Karakterizasyonu

Periferik kan mononükleer hücrelerinin (monositler, CD4 + T hücreleri, CD8 + T hücreleri, B hücreleri ve doğal öldürücü hücreler) tanımlanmış bağışıklık hücresi alt popülasyonlarını izole etmek ve analiz etmek için immünomanyetik boncukları ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamasını birleştiren bir yöntem tanımladık. Bu yöntemi kullanarak, manyetik ve floresan olarak etiketlenmiş hücreler saflaştırılabilir ve analiz edilebilir.

Enfeksiyöz Mononükleozlu Çocuklardan Periferik Kan Örneklerinde İmmün Hücre Alt Popülasyonlarının Ayrılması

Bu protokol, Epstein-Barr virüs parçacıklarının, forbol 12-miristat 13-asetat ile viral litik döngüyü indükledikten sonra insan P3HR1 hücre hattından izole edilmesine izin verir. DNA daha sonra viral preparattan çıkarılır ve viral parçacık konsantrasyonunu ölçmek için gerçek zamanlı PCR'ye tabi tutulur.

Epstein-Barr Virüsünün P3HR1 Hücre Hattından İzolasyonu ve Nicelleştirilmesi

Bu video, fare timik lenfoma hücre hatları kurmak için bir protokol göstermektedir. Ve p53-/ - farelerde timus lenfoma ile bu protokolü takip ederek, başarıyla birkaç Atm / T-hücre hatları kurduk.

Timik Lenfoma T-hücre Hatları türetilmesi Atm - / -</sup Ve P53 - / -</sup Fare

Öğrenin Epstein-Barr virüsüyle dönüştürülmüş lenfoblastoid hücre hatları oluşturma yöntemini. İnsan B hücrelerinden izolasyon, enfeksiyon ve erken dönüşüm belirteçleriyle viroloji araştırmalarınızı hızlandırın.

Epstein-Barr Virus Büyüme dönüştürülmüş lenfoblastoid hücre dizilerinde kurulması

Daha fazla video keşfet