Name: Post-natal murin Dokular Co-kültürler Myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit Kültürleri ve oligodendrosit / Nöron türetilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: Öğrenin, fare oligodendrosit öncü hücrelerini izole etme ve dorsal kök ganglion nöronlarıyla miyelinleştiren ko-kültürler oluşturma yöntemlerini. Bu teknik, sinir sistemi hastalıklarını araştırmak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje, Kanada Multipl Skleroz Derneği RKRWO bir hibe ile finanse edildi Kanada Multipl Skleroz Derneği Bursu bir alıcı. SDR, Kanada ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri Multipl Skleroz Derneği Doktora Sonrası Araştırma Bursu bir alıcı.

<ol><li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+%22oligospheres%22+that+retain+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> Cell. 70, 31-46 (1992).</li>
<li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43, 183-1891 (2004).</li>
<li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).</li>
<li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> Neuron. 49, 823-832 (2006).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li>
<li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+characterization%2C+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> Glia. 56, 1339-1352 (2008).</li>
<li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+%28NGF%29+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> Dev Biol. 58, 106-113 (1977).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu rapor, kültürleri ya da OL-zenginleştirilmiş DRGN / OL ortak kültürler farklılaşma fare OPC izole etmek için bir yöntem açıklanır. Yalnız kültür, OPC MBP içine ayırt + Ve EKK, miyelin benzeri membranöz levha üretim. Neurite yatak DRGN eklendiği zaman, OLS MBP DRGN neurites sarmak + ve membran. Bu model, OL-aracılı aksonal ensheathment yöneten karmaşık temellerinin araştırılması yarar sağlar. Büyük bir değer olsa da, bu tür kültürlerin kurulması, teknik olarak çok zordur. Özellikle zorlu yönlerini etkili doku sindirim / disosiasyon, dengeli bir kültür ortamı pH bakım ve DRGN medya değişiklikleri içerir. Sindirim uzunluğu, doku miktarı sindirilir ve öğütme miktarı doku ayrılma etkinliği ve sonuçta etkiler olduğunu göz önünde bulundurmak önemlidir. Ayrışmış sinir sistemi dokularında düşük hücresel verimi elde etmek için deneyimli araştırmacılar için alışılmadık bir durum değildir. Buna ek olarak, fare OPC, özellikle alkali koşullar altında, kültür ortamı pH değişikliklerine duyarlı olma eğilimindedirler. % 8.5 CO 2 kültürlerin bakım OPC temel üzerinde hafif asidik koşullarda daha iyi tolere görünen bu yana, bu önlemek için amaçlamaktadır. Ancak, medya değişiklikleri, beslenme DRGNs ile ilgili olarak, nöronlar ile kurutun olarak hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir olmalıdır gelişmekte neurite yatak bozmayacak gibi hafif olmalıdır. Ani medya değişiklikleri yüzey neurite yatak, ve lamel tam ayrılma olası sonuç yerinden olabilir. Bu model sisteminin potansiyel liyakat, teknik açıdan zorlu doğa büyük ölçüde düşer. Bu sistemin bir avantajı, embriyonik doku hasat üreme kadın feda etmeye gerek engellemeyi, hücre kültürü derivasyon için post-natal farelerin kullanılması. Diğer bir avantajı OPC genişlemesi için büyüme faktörleri için gereğinin olmaması (GDS). Karışık glial kültürler astrosit türetilen trofik faktörlerin varlığı nedeniyle muhtemelen OPC yayılmasını destekleyen bir ortam sağlar. Türetme yoluyla neurospheres 7,8 gibi diğer yöntemler, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), epidermal büyüme faktörü (EGF) ve OPC genişleme için trombosit kökenli büyüme faktörü (PDGF) gibi GF&#39;lerin mitojenik özellikleri güveniyor. Benzer şekilde, postnatal (P5-10) DRGNs için fareler kullanarak, sinir büyüme faktörü (NGF), embriyonik DRGNs 9, 10, in vitro hayatta kalmak için gerekli bir nörotrofik faktör ile kültür ortamı tamamlayan gereği önler . Ilgi DRGNs 4 ile kültüre EKK&#39;nın myelinating kapasitesini olumsuz etkiler olarak NGF kullanmaktan kaçının. Kullanımı kaçınmak GF-desteklenmiş büyük ölçekte kullanılan bu reaktifler pahalı gibi medya da, ekonomik faydaları vardır. Belki de bu kültürün modelin en önemli yararı, bu nedenle, transgenik fare hatları çok çeşitli OPC ve DRGNs elde etmek için fırsatlar sağlayarak, sadece fare dokuları türevidir. Bu her iki DRGN ve / veya miyelinasyonun yöneten OPC-spesifik özellikleri çalışma için izin verir. Bu aksonlar OL-aracılı miyelinasyonun düzenleyen reseptör / ligand etkileşimleri nedenlerine açıklık için özellikle önemli olacaktır. Bu teknikte, miyelinasyonun altında yatan moleküler ipuçları anlamaya yönelik uygulamaları nedeniyle nörolojik araştırma açısından büyük bir değer taşımaktadır.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Ürün Adı </td><td> Şirket </td><td> Ürün Numarası </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Medium (DMEM) </td><td> Çok hücreli </td><td> 319-005-CL </td></tr><tr><td> Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> Minimum Essential Medya (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 12360-038 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 10091-148 </td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin (Pen / Strep) </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td></tr><tr><td> Poli-L-lisin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2636 </td></tr><tr><td> Sığır Serum Albumin (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> İnsan merosin saflaştırılmış protein (LN2) </td><td> Millipore </td><td> CC085 </td></tr><tr><td> Rekombinant sıçan siliyer nörotrofik faktör (CNTF) </td><td> PeproTech </td><td> 450-50 </td></tr><tr><td> L-tiroksin </td><td> BioChemika </td><td> 89430 </td></tr><tr><td> Holo-transferrin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0665 </td></tr><tr><td> B27 takviyesi </td><td> Gibco </td><td> 0080085-SA </td></tr><tr><td> Sığır insülin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-Triiodo-L-thyronine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8783 </td></tr><tr><td> Putrescine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7505 </td></tr><tr><td> Sodyum Selenit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td></tr><tr><td> 5-Fluoro-2&#39;-dezoksiuridin (FuDR) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Papain çözüm </td><td> Worthington </td><td> LS003126 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> ROCHE </td><td> 1010159001 </td></tr><tr><td> L-sistein </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7352 </td></tr><tr><td> 24-iyi doku kültürü yemekleri </td><td> Cellstar </td><td> 662-160 </td></tr><tr><td> Havalandırma kapağı ile T25-doku kültürü şişeleri </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> 10 cm doku kültürü yemekleri </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 10 cm&#39;lik petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713 </td></tr><tr><td> Kollajenaz A </td><td> ROCHE </td><td> 103578 </td></tr><tr><td> CellTrics 50 mikron filtre (opsiyonel) </td><td> PARTEC </td><td> 04-004-2327 </td></tr><tr><td> Miyelin Temel Protein (MBP) Antikor </td><td> Abd Serotec </td><td> MCA409S </td></tr><tr><td> NG2 antikor </td><td> Millipore </td><td> AB5320 </td></tr><tr><td> Miyelin İlişkili Glikoprotein (MAG) antikor </td><td> Millipore </td><td> MAB1567 </td></tr><tr><td> 2 &#39;, 3&#39;-Siklik nükleotid 3&#39;-fosfodiesteraz (CNP) antikor </td><td> Covance </td><td> SMI-91R-100 </td></tr><tr><td> Aktin pan Ab-5 antikor </td><td> Fitzgerald </td><td> 10R-A106AX </td></tr><tr><td> Nörofilaman-200 (NF) antikor </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N4142 </td></tr><tr><td> Tubulin beta-3 zinciri (Tuj1) antikoru </td><td> Millipore </td><td> MAB5544 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG (H + L) sekonder antikoru </td><td> Invitrogen </td><td> A11008 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 keçi anti-fare IgG (H + L) sekonder antikoru </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 keçi anti-sıçan (IgG) (H + L) sekonder antikoru </td><td> Invitrogen </td><td> A21247 </td></tr><tr><td> Keçi anti-fare IgG (H + L)-HRP konjuge sekonder antikor </td><td> BioRad </td><td> 170-6516 </td></tr><tr><td> Keçi anti-sıçan IgG (H + L)-HRP konjuge sekonder antikor </td><td> Santa Cruz Biyoteknoloji </td><td> SC-2065 </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9542 </td></tr></tbody></table> Medya Tarifler OL-100X Ek * <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Eklenecek tutar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1.02 g </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> 0.6 mg </td></tr><tr><td> Putrescine </td><td> 161 mg </td></tr><tr><td> Sodyum Selenit </td><td> 0.05 mg </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-Triiodo-L-thyronine </td><td> 4 mg </td></tr></tbody></table> * Mağaza -80 ° C 250 mcL alikot &quot;t&gt; OL medya <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Eklenecek tutar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 23.75 ml </td></tr><tr><td> 100X OL-Ek </td><td> 250 mcL </td></tr><tr><td> Sığır insülin (1 mg / ml stok) </td><td> 125 mcL </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> 250 mcL </td></tr><tr><td> Holo-transferrin (33 mg / ml stok) </td><td> 37.5 mcL </td></tr><tr><td> B27 Supplement </td><td> 500 mcL </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 125 mcL </td></tr><tr><td> CNTF (50 mcL ng / stok) </td><td> 25 mcL </td></tr></tbody></table> Karışık glial kültür ortamı (DMEM içinde oluşur) <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Final konsantrasyonu </td></tr><tr><td> FBS </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> Pen / Strep (% 0.33 stok) </td><td> 33 adet / ml penisilin ve 33 mg / ml Streptomisin </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> % 1 </td></tr></tbody></table> DRGN medya (DMEM içinde oluşan) <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Final konsantrasyonu </td></tr><tr><td> FBS </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> Pen / Strep (stok% 1) </td><td> 100 birim / ml penisilin ve 100 mg / ml Streptomisin </td></tr></tbody></table> Sindirim Çözüm Tarifler: OPC papain solüsyonu (MEM yılında yapılan) <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Final konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Papain çözüm </td><td> 1.54 mg / ml </td></tr><tr><td> L-sistein </td><td> 360 mcg / mL </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 60 mcg / mL </td></tr></tbody></table> DRG papain solüsyonu (HBSS içinde oluşan) <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Final konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Papain </td><td> 1.54 mg / ml </td></tr><tr><td> L-sistein </td><td> 360 mcg / mL </td></tr></tbody></table> DRG kollajenaz (HBSS içinde yapılmış bir çözüm) <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Final konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Kollajenaz A </td><td> 4 mg / ml </td></tr></tbody></table>

post-natal murin dokular co-kültürler myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit kültürleri ve oligodendrosit / nöron türetilmesi

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

OL geliştirme altında yatan moleküler mekanizmaları belirleme OL biyoloji bilgimizi ilerletmek için yalnızca kritik değil, Multipl Skleroz (MS) gibi demiyelinizan hastalıkların patogenezinde anlamak için de etkileri vardır. Hücresel gelişimi sık primer hücre kültür modelleri ile çalışılmaktadır. Primer hücre kültürü, in vivo olarak bulunan gereksiz değişkenlerin kontrollü bir ortam sağlayarak, belirli bir hücre tipi değerlendirilmesi kolaylaştırır . Sıçanlarda türetilen OL kültürler OL biyoloji içgörü büyük bir miktar olsa da, fareler OL kültürler kurmayı benzer çabalar büyük engellerden ile karşılandı. Transgenik fare hatları yararlanmak amacıyla kültür fare primer OLS için yöntemler geliştirmek zorunludur. Neurosphere türev, diferansiyel yapışma arıtma ve 1-3 immunopurification arasında değişen, kemirgen dokusundan OPC çıkarılması için birden çok yöntem tarif edilmiştir. Pek çok yöntem başarı sunarken, en kapsamlı kültür ve / veya pahalı ekipman / reaktifler gerektirir. Bunu aşmak için, başlangıçta McCarthy &amp; de Vellis 2 tarafından açıklanan yöntemi bir adaptasyon fare doku OPC arındırıcı tercih edilir. Bu yöntem, fiziksel neonatal kemirgen korteks türetilen karışık bir glial kültüründen ayıran OPC içerir. Sonuç, bir saflaştırılmış OPC nüfusu OL-zenginleştirilmiş kültür ayrılabilir. Bu yaklaşım, görece kısa bir kültür zaman ve büyüme faktörleri veya immunopanning antikorlar için gereksiz gereksinimi nedeniyle itiraz ediyor. , Saflaştırılmış bir kültür OL gelişme mekanizmaları keşfetmek bilgilendirici olmasına rağmen, miyelin kılıf oluşumu değerlendiren için en önemli fizyolojik bir ortam sağlamaz. Co-kültür OLS nöron aksonları OL-aracılı miyelinasyonun düzenleyen moleküler temellerinin içgörü ödünç. / OL nöron ko-kültür çalışmaları birçok insan için, dorsal kök ganglion nöronlar (DRGNs) seçim nöron türü olduğu kanıtlanmış. Ekstraksiyon, kirlenmesine neden olan hücreler az miktarda ve yoğun neurite yatak oluşumu kolaylığı nedeniyle OLS ile ko-kültür için idealdir. 4-6 xenocultures myelinating sıçan / fare kullanarak çalışmalar yayınlanmış olsa da, böyle derivasyon için bir yöntem DRGN / OL post-natal fare doku ortak kültürler myelinating tanımlanmıştır değil. Burada etkili beklenen sonuçlar örnekleri ile birlikte, bu tür kültür üretmek için nasıl ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Bu yöntemler OL geliştirme / myelinating fonksiyonu ile ilgili sorulara yanıt için yararlı ve faydalı araçlar sinirbilim alanında.

Bu makale, olgun oligodendrosit (EKK) üretmek için ayırt primer kültür fare oligodendrosit öncü hücreler (OPC) zenginleştirilmiş nüfus, elde etmek için yöntemler anlatılmaktadır. Buna ek olarak, bu rapor üretmek için teknikler açıklar fare fare dorsal kök ganglion nöronlar (DRGNs) neurite yatağa fare OPC ekim ortak kültürler myelinating.

Post-natal murin Dokular Co-kültürler Myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit Kültürleri ve oligodendrosit / Nöron türetilmesi

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Merhaba, ben Ottawa Üniversitesi ve Ottawa Hastanesi Araştırma Enstitüsü'nden doktora öğrencisi Ryan O'Mara. Bu protokol, tek başlarına veya myelin üreten kokültürler oluşturmak için fare dorsal kök ganglion nöronlarıyla birlikte farklılaştırılabilen, farelerden zenginleştirilmiş oligodendrosit öncül hücre popülasyonlarının nasıl üretileceğine yönelik yöntemleri açıklayacaktır. Prosedürün kısa bir genel bakışıyla başlayalım.Yenidoğan fare korteksleri disosiye edilir ve T 25 flasklara yerleştirilir. Dokuz günlük bir kültür süresinin ardından, flask tabanında bir astrosit monokatmanı oluşur ve bu katmanın üzerinde oligodendrosit öncül hücreleri çoğalır. Daha sonra oligodendrosit öncül hücreleri elde edilip saflaştırılır ve ardından zenginleştirilmiş bir kültürde olgun oligodendrositlere farklılaştırılabilir.Miyelinize ko-kültürler isteniyorsa, P5 ila P10 arası farelerden elde edilen dorsal kök ganglion nöronları, karışık glial kültürlerle birlikte kültüre edilir. Dokuz günlük bir süre boyunca bu nöronlar, üzerine oligodendrosit öncül hücrelerinin ekilebileceği yoğun bir nörit yatağı oluşturur.Bu durum, nöritlerin oligodendrosit aracılı sarmalanmasına olanak tanır ve böylece miyelinize edici bir soğuk kültür ile sonuçlanır. İlk olarak, P sıfır ile P iki arasındaki farelerin tüm beyinleri buz gibi soğuk MEM içerisine yerleştirilir ve bir diseksiyon mikroskobuna aktarılır; her bir korteksin meningeal tabakası bir skalpel yardımıyla boylamasına kesilir. Ardından, meningesler altta kalan korteksten sıyrılıp çıkarılır. Sonrasında, beyin ventral tarafı yukarı bakacak şekildeyken olfaktör bulblar çıkarılır.Kortekslerin ventral sefalona birleştiği noktalardan derin boyuna kesiler yapın. Beynin dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde korteksleri yerinden çıkarın, ardından her bir korteksi yaklaşık dört parçaya bölün. Korteksleri, beyin başına 350 µL buz gibi soğuk MEM içeren 15 mL'lik konik tüplere aktarın.Aynı genotipe sahip beyinler aynı tüpte toplanır; böylece dört beyin için 1400 microliters MEM gerekir. Diseksiyon tamamlandığında, toplanan beyinleri üç dakika boyunca 37 degree su banyosuna yerleştirin. Ardından, steril bir doku kültürü kabininde, beyin parçalarını daha küçük parçalara ayırmak için bir P 1000 pipet ucu üzerinden geçirin.Konik tüpe beyin başına 75 µL önceden ısıtılmış OPC Pap pain ekleyin. Ardından, doku agregasyonunu önlemek için tüpü her iki dakikada bir tersyüz ederek 37 °C sıcaklıktaki su banyosunda 20 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyon tamamlandığında, sindirilmiş örneğe beyin başına iki mililitre karışık glial kültür medyumu ekleyin ve 10 dakika boyunca bekletin. 10 dakika sonra, doku süspansiyonunu beş mililitrelik plastik tüplere paylaştırın.Tüp sayısı, preparasyondaki beyin sayısıyla eşleşmelidir. Alevle cilalanmış cam pastoral pipet kullanarak, her tüpün içeriğini önce yavaşça, ardından parçalar ayrışmaya başladığında artan bir yoğunlukla tritüre edin. Süspansiyonda görünür doku parçası kalmadığında tritürasyonu durdurun. Her tüpün içeriğini, dört mililitre karışık glial kültür içeren 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın.Tüpü birkaç kez nazikçe altüst ettikten sonra, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik tüplere paylaştırın. Tüp sayısı, preparasyondaki beyin sayısı ile eşleşmelidir; tüpleri 300 ×g'de beş dakika santrifüj edin ve peletleri bir mililitre karışık glial kültür besiyerinde yeniden süspanse edin. Her konik tüpteki yeniden süspanse edilmiş hücreleri, beş mililitre karışık glial kültür besiyeri ile önceden dengelenmiş poli L-lizin kaplı T 25 flasklara ekleyin.Erlenmayerlerin sayısı, diske edilen beyinlerin sayısına eşit olmalıdır; erlenmayerleri 37 °C sıcaklıktaki ve %8,5 CO2 içeren inkübatörde inkübe edin. Üç ila dört saat sonra, hücreler substrata tutunmuş olmalıdır. Ancak, besiyerinde hücre canlılığını olumsuz etkileyebilecek çok miktarda kalıntı kalacaktır.Bunu önlemek için, mümkünse üç ila dört saat sonra medyumu taze karışık glial kültür medyumu ile değiştirin. Bu medyum değişimi, hücresel döküntülerin çoğunu uzaklaştırır. Ertesi gün.Balonun tabanında birçok hücre belirgin olmalıdır. Üçüncü günde, balonun tabanında bir astrosit monokatmanı oluşmuş olmalıdır. Bu aşamada, dört mililitre medyum çıkarıp yerine dört mililitre taze medyum ekleyerek medyumun üçte ikisini değiştirin.Bu adım her üç günde bir tekrarlanmalıdır. Altıncı günde, üzerinde oligodendrosit öncül hücrelerinin prolifere olduğu bir astrosit monotabakası net bir şekilde görülmelidir. Bu noktada, kültür ortamı final konsantrasyonu 5 µg/mL olacak şekilde insülin ile takviye edilmelidir; dokuzuncu günde oligodendrosit öncül hücreleri, astrosit monotabakasından ayrılmaya hazır hale gelir.Bunu yapmak için, flaskları bir orbital çalkalayıcıya ve %5CO2 inkübatöre yerleştirin. Flaskın bu inkübatörle dengelenmesi için bir saat bekleyin. Ardından, hücreleri 50 RPM hızında 45 dakika boyunca çalkalayın.Bu adım, gevşek şekilde tutunmuş birçok kontamine hücreyi uzaklaştırır. Tüm medyumu uzaklaştırıp yerine dört mililitre taze kültür medyumu ekleyerek tam bir medyum değişimi gerçekleştirin. Balonu %5CO2 inkübatörüne geri yerleştirin ve üç saat boyunca dengelenmeye bırakın.Üçüncü saatte, kültür ortamının rengini kontrol edin. Kültür ortamı, dengeli bir pH değerini belirtecek şekilde kırmızı olmalıdır. Renk turuncuya veya mora yakınsa, inkübatör CO2 seviyesini buna göre ayarlayın.Gece boyu süren çalkalama işlemi sırasında oligodendrosit öncül hücrelerinin hayatta kalması için dengeli bir pH'ın korunması önemlidir. Dengeli bir pH elde edildikten sonra, erleni yaklaşık 16 saat boyunca 220 RPM'de çalkalayın. Ertesi sabah erleni çalkalayıcıdan çıkarın ve erlenlerdeki medyumu 10 santimetre doku kültürü kaplarına aktarın.Bu kaplar, oligodendrosit öncül hücrelerini diferansiyel adezyon yoluyla daha fazla saflaştırmak için kullanılacaktır. Her kaba iki flasktan medya ekleyin ve kapları %5 CO2 ortamında 30 dakika boyunca inkübe edin. 15. dakikada, oligodendrosit öncül hücrelerinin plastiğe yapışmasını önlemek için her kabı hafifçe sallayın.30 dakikalık inkübasyonun ardından, kapları faz kontrast mikroskobu altında inceleyin. Oligodendrosit öncül hücreleri, küçük hücre kümeleri şeklinde görülür. Bu hücrelerin bazıları kaba yapışmış olabilir.Yapışmış oligodendrosit öncül hücrelerini, hafifçe çalkalayarak kapta serbest hale getirin. Dikkatli olun. Aşırı çalkalama, kontamine hücre tiplerinin de serbest kalmasına neden olabilir.Hücre süspansiyonunu 15 Milliliter'lik konik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 300 Times gravity hızında santrifüjleyin. Pelleti bir P 1000 pipet ucuyla nazikçe yeniden süspande edin. Ardından bir P 200 pipet ucu kullanarak hemositometre ile hücre sayımı yapın; saflaştırılmış oligodendrositler, birinci günde zenginleştirilmiş oligodendrosit kültürlerine farklılaşmaları için laminat kaplı lameller üzerine yerleştirilebilir.Ekimi takip eden süreçte, zenginleştirilmiş oligodendrosit öncül hücreleri, yalnızca birkaç uzantı sergileyen nispeten basit bir morfolojiye sahiptir. Üçüncü güne gelindiğinde, farklılaşan oligodendrositler, olgunlaşmamış oligodendrositleri anımsatan çok sayıda uzantı geliştirmişlerdir. Altıncı güne gelindiğinde ise, oligodendrositler bu sürenin herhangi bir noktasında miyelin benzeri membranöz tabakalar oluşturmuşlardır.Kurs örtü lamları sabitlenebilir ve immünosito kimyası için işlenebilir. Purifiye edilmiş Oligodendrosit öncül hücrelerini laminin kaplı örtü lamlarına ekmek yerine, miyelinizasyon yapan ko-kültürler üretmek için dorsal kök ganglion nörit yataklarına ekleyebilirler. Bir sonraki bölüm, bu kültürlerin nasıl üretileceğine dair yöntemleri açıklayacaktır.Başlamak için P5 ile P10 arası farelerden tüm omurgaları izole edin ve diseksiyon makasıyla bir diseksiyon mikroskobuna aktarın. Omurganın ventral medial bölgesini boylamasına kesin. Dorsal kök ganglionlarını veya DRG'leri ince uçlu pensetlerle dikkatlice çıkarın.Ganglionları bir Petri kabındaki Hank dengeli tuz çözeltisine aktarın. DRG'lerin aşırı uzun olan köklerini kesin. P 1000 geniş ağızlı pipet ucu kullanın.Ganglionları 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüm fareler işlenene kadar tüpü buz üzerinde tutun. DRG izolasyonu tamamlandığında, tüpü yaklaşık 300 ×g hızda santrifüjleyin.Tüpü steril bir doku kültürü kabinine aktarın ve süpernatanı uzaklaştırın. Tüpe 500 µL önceden ısıtılmış DRG papain ekleyin ve 37 °C sıcaklıktaki su banyosunda 10 dakika inkübe edin. Papain sindirimi tamamlandığında santrifüj yapın ve ardından papain çözeltisini değiştirin.500 µL önceden ısıtılmış kollagenaz A çözeltisi ile 37 °C'de 10 dakika inkübe edin. Santrifüj adımını tekrarlayın ve kollagenaz A çözeltisini 1 mL DRGN kültür medyumu ile değiştirin. Son santrifüj adımından sonra, 1 mL DRGN medyumu ekleyin ve alevle sterilize edilmiş cam pastör pipeti ile aktarın.Gangliyonları önce yavaşça, ardından doku ayrışmaya başladıkça artan bir yoğunlukla tritüre edin. Artık görünür doku parçası kalmadığında, hücre süspansiyonunu yedi mililitre DRGN medyumu içeren bir Petri kabına aktarın. Kabı 37 °C sıcaklıktaki bir inkübatörde %8,5 CO2 ortamında bir buçuk saat inkübe edin.Bu inkübasyonun ardından Petri kabını gözlemleyin. Faz kontrastında, DRG nöronları geniş gövdeli hücreler olarak görülür. Birçok kontamine hücre Petri kabına sıkıca yapışmış olmalıdır.Besiyerini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve kalan nöronları toplamak için plakayı dört mililitre DRGN besiyeri ile durulayın. Konik tüpü 300 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Oluşan peleti 500 µL DRGN besiyeri ile yeniden süspande edin.Hücreleri bir HEO sitometresi kullanarak sayın. Sadece DRG nöronlarını saydığınızdan emin olun; bir mililitre DRGN medya kültürü içinde, 12 milimetrelik laminat kaplı lamel başına 30 ila 50.000 nöron ekleyin. Hücreleri %8,5 CO2'li bir doku kültürü inkübatöründe tutun.Ertesi sabah, DRGN medyumunu her iki günde bir 10 micromolar FUD R ile desteklenmiş ol medyumu ile değiştirerek tam bir medyum değişimi gerçekleştirin. Bunun ardından, FUD r ile desteklenmiş OL medyumu ile dörtte üç oranında medyum değişimi yapın. Birinci günde faz kontrast mikroskobu altında incelendiğinde, nöronların birkaç uzantı çıkarmaya başladığı görülür. Üçüncü günde, nöronal uzantılar uzamıştır.Altıncı günde, birçok birbirine karışmış uzantıdan oluşan bir nörit yatağı gelişmiştir. Dokuzuncu günde, bu nörit yatağının yoğunluğu artmıştır ve karma beyin kültürleri büyütülerek oligodendrositlerin kabulüne hazır hale getirilmiştir. Nöron kültürleri ile birlikte, nöron kültürlerinin dokuzuncu gününde oligodendrosit öncül hücreleri saflaştırılabilir.Ardından bunlar nörit yataklarının üzerine yerleştirilebilirler. 24 kuyucuklu bir plağın her kuyucuğuna 50.000 hücre eklenir. Ko-kültürün altıncı gününde, oligodendrositleri andıran hücrelerin DRG nöronlarıyla etkileşime girdiği görülebilir.Bu kültürler artık immünositokimya için fikse edilebilir ve işlenebilir. Zenginleştirilmiş oligodendrosit kültürleri, oligodendrosit belirteçleri olan NG2, MAG ve MVP'ye karşı antikorlarla işaretlendiğinde, evreye özgü morfolojiler sergileyen immünolojik olarak pozitif hücreler görülür. Bu kültürler başlangıçta NG2 pozitif oligodendrosit öncülleri popülasyonu olarak ortaya çıkar ve altı günlük farklılaşma süreci boyunca MAG pozitif olgun oligodendrositler üretir.Oligodendrositlerle zenginleştirilmiş kültürlerden elde edilen lizatlar üzerinde SDS-PAGE uygulandığında, oligodendrositlerin altı günlük zaman seyri boyunca CNPP ve MVP eksprese ettiği görülebilir. Oligodendrositlerin eklenmesinden önceki DRG nöronlarına bakıldığında, dokuzuncu günde yoğun Taj1 ve nörofilament pozitif nörit yatakları kanıtlanmıştır. Oligodendrosit-DRG nöronu ko-kültürünün altıncı gününde, yüksek büyütmede birçok MBP pozitif oligodendrositin nöron nöritleri ile etkileşim halinde olduğu görülebilir.Oligodendrositlerin, bu nöritleri miyelinasyonu anımsatan MBP pozitif membranla sardığı görülmektedir; dijital olarak büyütülmüş bir görünüm, MVP pozitif membranın nörofilament pozitif çıkıntı üzerindeki örtüşme derecesini göstermektedir. Merhaba, ben Ottawa Hastanesi Araştırma Enstitüsü'nde doktora sonrası araştırmacı Scott Ryan. Bu teknikler, farelerden glia, endotel ve DRG nöronu ko-kültür sistemleri oluşturmanın bir yolunu sunmaktadır.Bu teknik, hem deneysel olarak oluşturulmuş hem de transgenik miyelinizasyon hastalığı modellerinin incelenmesinde değerlidir. Ayrıca, yeni terapötik bileşiklerin taranmasında da etkilidir.

derivation-enriched-oligodendrocyte-cultures-oligodendrocyteneuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, fetal spinal kablolarından Glial Yasak Öncüleri derivasyon özetliyor ve transplantasyon için veya oligodendrocytic soyunun çalışma için ya in vitro korunmuştur.

E13 farelerin Glial Yasak Öncüleri türetilmesi

İlköğretim, insan fetal beyin-türevli, multipotential progenitör hücreler...

İnsan Fetal Beyin gelen Progenitör-türetilmiş Oligodendrosit Kültür Sistemi

Bu video, yetişkin fare beyninden lateral ventrikül duvarlarını izole etmek ve tek hücreler elde etmek için enzimatik doku ayrışması gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol göstermektedir. Bu hücreler daha sonra nöral kök hücrelerin proliferasyonunu seçici olarak artıran ve bunların oligodendrositlerin ve astrositlerin ko-kültürlerine farklılaşmasını teşvik eden spesifik kültür koşullarına tabi tutulur.

Yetişkin fare nöral kök hücrelerinden karışık oligodendrosit ve astrosit kültürü elde edilmesi

Bu video, insan embriyonik kök hücrelerinden oligodendrosit öncü hücrelerinin (OPC'ler) üretilmesi sürecini ve ardından OPC'lerin oligodendrositlere olgunlaşmasını göstermektedir. Bu oligodendrosit üretme süreci, Alzheimer da dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların araştırma ve tedavisini iyileştirmek için çok sayıda yol açar.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Oligodendrositlere Farklılaşması

Bu video, insan kaynaklı nöronların (iN'ler) ve indüklenmiş oligodendrosit öncü hücrelerinin (iOPC'ler) bir ko-kültürünün kurulmasını göstermektedir. iN'ler bir ko-kültürde iOPC'lerle karıştırılır ve daha sonra her iki iN'nin nöronlara ve iOPC'lerin oligodendrositlere olgunlaşmasını desteklemek için inkübe edilir. Nöronlar, diğer nöronlar ve oligodendrositlerle sinaptik bağlantılar oluştururken, oligodendrositler, nöronların aksonlarının etrafında miyelin kılıfları geliştirir.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Bir Ko-Kültür Yöntemi

Video, oligodendrosit öncü hücrelerini (OPC'ler) oligodendrositlere farklılaştırmak ve dorsal kök ganglion (DRG) nöronları ile bir ko-kültürde miyelinasyonu indüklemek için bir protokolü göstermektedir. OPC'ler, miyelinasyonu düzenleyen bir sinyal proteinini kodlayan lentiviral vektörlerle dönüştürülür. Dönüştürülen OPC'ler, oligodendrositlere farklılaşmayı ve sinyal proteini kaynaklı miyelinasyonu değerlendirmek için DRG nöronları ile birlikte kültürlenir.

Oligodendrosit Öncü Hücreleri için İn Vitro Transdüksiyonla İndüklenen Miyelinasyon Testi

Oligodendrositler, merkezi sinir sisteminin miyelinli hücreleridir. Bu protokol, öncülleri olan oligodendrosit progenitör hücrelerinin sıçan kortekslerinden izolasyonu ve kültürü için bir yöntemin yanı sıra, deneysel faktörlere yanıt olarak in vitro oligodendrogenezi değerlendirmek için hızlı ve güvenilir bir kantitatif yöntemi tanımlar.

Sıçan oligodendrosit Progenitör Kültürler hazırlanması ve Oligodendrogenesis Niceleme Çift kızılötesi Floresan Tarama kullanma

Birincil fare oligodendrocytes, immunomagnetic izolasyonu vitro kültür için hücreleri hızlı ve spesifik yalıtım sağlar açıklar.

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

Burada, oligodendrositlerin saflaştırılması ve ortak kültür deneyleri için kullanılabilecek oligodendrosit şartlı ortamın üretimi için etkili bir yöntem gösteriyoruz.

Oligodendrocytes ve Oligodendrocyte-Ko-Kültür Deneyleri için Şartlı Orta Üretimi

Nörodejenerasyonda nöron-glial etkileşimler yetersiz araç ve yöntemler nedeniyle iyi anlaşılamamıştır. Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden indüklenmiş nöronlar, oligodendrosit öncü hücreleri ve oligodendrositler elde etmek için optimize edilmiş protokolleri açıklıyoruz ve Alzheimer hastalığında hücre tipine özgü katkıları anlamada bu yöntemlerin değerlerine örnekler sunuyoruz.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerin Üretilmesi

Olgun oligodendrositlere dönüşen fetal veya yetişkin nöral kök hücrelerden elde edilen astrositlerin ve oligodendrosit öncül hücrelerin karma kültürlerinin üretimini ve zararlı uyaranların in vitro modellemesini anlatıyoruz. Hücre tabanlı yüksek içerikli tarama tekniği ile bağlantı, güvenilir ve sağlam bir ilaç tarama sistemi oluşturur.

Fetal ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Türevi Oligodendrosit Öncül Hücre Kültürlerinin Yüksek İçerik tarama farklılaşması ve olgunlaşma analizi

Öğrenin, fare oligodendrosit öncü hücrelerini izole etme ve dorsal kök ganglion nöronlarıyla miyelinleştiren ko-kültürler oluşturma yöntemlerini. Bu teknik, sinir sistemi hastalıklarını araştırmak için değerlidir.

Post-natal murin Dokular Co-kültürler Myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit Kültürleri ve oligodendrosit / Nöron türetilmesi (Video) | JoVE Journal

Post-natal murin Dokular Co-kültürler Myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit Kültürleri ve oligodendrosit / Nöron türetilmesi

Daha fazla video keşfet