Yaşayan Hücreler ubikitin-proteozom Faaliyet Monitoring Degron (DGN)-destabilize Yeşil floresan proteini (GFP) tabanlı Muhabir Protein Kullanımı

Bu prosedürün genel amacı, yaşayan hücrelerde proteazom aktivitesini bir GFP Deron füzyon proteini kullanarak ölçmektir; önce Deron ve Deron frameshift için özel oligonükleotidleri klonlayın. P-E-G-F-P-C bir vektörünü girin ve ardından Vitrogen'deki gateway sistemi protokollerini uygulayın, daha sonra HEK 2 93 FT hücrelerini kullanarak her bir konstrükt için virüsler üretin. Titreyi belirledikten sonra hücreleri virüsle transduse edin ve antibiyotik seçimi uygulayın, ardından ortaya çıkan stabil GFP DRON veya GFP Dron frameshift eksprese eden hücreleri genişletin.

Bu teknik, floresan sinyal ölçümleri aracılığıyla hücrelerin belirli işlemlere verdiği yanıtların izlendiği deneyleri kolaylaştırır. Örneğin, proteazom aktivitesi epi-floresan mikroskopi veya akış sitometrisi kullanılarak kolayca değerlendirilebilir. Bu tekniğin, tüm hücreli asitler kullanan lüminojenik veya florojenik assayler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, proteazom aktivitesinin canlı hücrelerde ölçülmesidir. Transfeksiyon için, 36 µL lipo 2000 reaktifini 1,5 mL DMEM içinde seyrelttirin; başka bir 15 mL'lik falcon tüpünde ise DNA konstrüktlarını 1,5 mL DMEM içinde seyrelttirin.

Beş dakika sonra, her iki bileşeni birleştirin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Şimdi, T 75 flaskındaki konfluen bir HEK 2 93 FT hücre kültürü ortamını yedi mililitre DMEM ile değiştirin. Ardından, DNA lipo karışımını flaska ekleyin ve flaskı ileri geri sallayarak karıştırın.

Balonu, %5 CO2 içeren bir inkübatörde 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, besiyerini 10 mL DMEM ile değiştirin. 48 saat sonra, süpernatantı toplayın. Virüs içeren süpernatantı 0,45 µm'lik bir PVDF filtreden süzün.

Virüsü konsantre etmek için, dört hacim süpernatana bir hacim PEG çözeltisi ekleyin ve ara ara ters çevirerek karıştırarak dört derece Celsius'ta iki saat boyunca inkübe edin. Virüsü santrifüjle toplayın; beyaz peletin supernatantını aspire ettikten sonra, kalan PEG çözeltisini uzaklaştırmak için tekrar santrifüjleyin. Final peleti pipet yardımıyla PBS içinde resüspande edin ve ardından 20 ila 30 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin.

Virüsün 100 µL'lik alikotlarını -80 °C'de saklayın. U2 OS hücrelerini altı kuyucuklu plaklara ekleyin ve gece boyunca inkübe edin. Transfeksiyon için, kültür ortamını mililitre başına 8 µg Polybrain içeren 1 mL DMEM ile değiştirin. Bir kuyucuğu pozitif kontrol olarak ayırın ve geri kalan kuyucuklarda bir dizi viral konsantrasyonu test edin.

Ertesi gün gece boyunca inkübe edin. Besiyerini iki mililitre DMEM ile değiştirin ve 24 saat boyunca inkübe edin. Seleksiyona mililitre başına 10 mikrogram blasticidin ile başlayın ve antibiyotik içeren besiyerini her iki günde bir değiştirmeye devam edin.

Yaklaşık altı ila yedi gün sonra, transduksiyon yapılmamış hücrelerin ölümünü doğrulayın. Ardından, hücreleri boyamak için hücreleri üç kez PBS ile yıkayın. Kristal viyole ile kaplayın ve oda sıcaklığında beş ila 10 dakika inkübe edin; ardından boyayı aspire edin, kuyucukları iki kez çift distile su ile durulayın ve plakayı havada kurutun.

Son olarak, mililitre başına virüs transfeksiyon birimlerini hesaplamak için kolonileri sayın. İnsan diplo fibroblastlarını, mililitre başına sekiz mikrogram Polybrene transduksiyon artırıcı ile birlikte altı kuyucuklu plaklara ekin.

Toplam bir mililitrede iki şeklinde bir enfeksiyon çokluğu kullanın. Besiyerini değiştirin. Ertesi gün kültür %70 ila %80 konfluenceye ulaştığında.

Kronik seçime mililitre başına 10 mikrogram ile başlayın. Günler geçtikçe hücre ölümlerini izleyerek seçimin tamamlandığını belirleyin. GFP DERON veya GFP Deron Frameshift füzyon proteinleri eksprese eden stabil bir hücre hattı oluşturmak için stabil olarak transdükse edilmiş hücreleri genişletin. GFP DRON veya GFP DRON frameshift taşıyan hücreleri ekerek başlayın; ertesi gün, faks işlemlerinden üç saat önce hazırlık yapın.

Kontrol hücrelerini bir proteazom inhibitörü ile muamele edin. PBS ile iki kez yıkayın ve 0.5 mililitre tripsin kullanarak hücreleri hasat edin. Tripsini durdurmak için.

4,5 mililitre kültür ortamı kullanın ve hücreleri 15 mililitrelik bir Falcon tüpe aktarın. Hücreleri santrifüj ile hasat edin. PBS ile bir kez yıkadıktan sonra, peleti 400 mikrolitre fax tamponu içerisinde yeniden süspande edin. Hücreleri fax tüplerine aktarın ve buz üzerine yerleştirin.

Şimdi örnekleri akış sitometrisi ile ölçün. GFP Deron füzyon proteini, anında yıkım için proteazoma yönlendirilen bir sekans taşır. Buna karşılık, çerçeve kayması mutantı GFP Deron FS, proteazomlar tarafından yıkılmaz.

Bu nedenle, GFP Deron ile transdukse edilen ve beklenen yüksek proteazomal aktiviteye sahip genç insan fibroblastları, epi floresan altında düşük floresan sinyali gösterir. GFP Deron Frameshift ile transdukse edilen aynı hücrelerde %39,7 oranında pozitif hücre görülmektedir. Hücrelerin proteazom inhibitörü ll ve L ile tedavisi, hem GFP dron hem de GFP Dron frameshift hücrelerinde sinyallerin yaklaşık %63'e kadar artmasıyla sonuçlanır.

Genç, orta yaşlı ve yaşlı donörlerden izole edilen dermal fibroblastlarda yapılan benzer ölçümler, genç bireyler ile orta yaşlı donörler arasında GFP sinyalinde belirgin bir artış olduğunu ortaya koymakta ve bu durum, yaşlı donörlerden alınan örneklerde proteazom aktivitesinin azaldığını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, lentiviral partiküllerin nasıl üretileceği, hücrelerin nasıl transfekte edileceği ve canlı hücrelerde proteazom aktivitesinin nasıl belirleneceği konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olacaksınız.