Name: Axon Rejenerasyon Eğitim Düşük bütçeli Lazer Axotomy Sistemi oluşturulması C. elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Öğrenin C. elegans'ta akson rejenerasyonunu incelemek için düşük maliyetli lazer aksotomi sisteminin montajını ve hizalanmasını. Bu yöntem, minimal hasarla hassas kesim sağlayarak sinirbilim araştırmalarında değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Ulusal Bilim Vakfı, Nörobilim McKnight Endowment Fund, Christopher ve Dana Reeve Vakfı ve Amerisure Vakfı tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li>
<li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature protocols. 5, 395-407 (2010).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage%2C+ephrin+signaling%2C+and+synaptic+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching.</a> Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).</li>
<li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).</li>
<li>Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+nanosurgery+and+cell+enucleation+using+a+picosecond+laser%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser.</a> J. Microsc. 234, 1-8 (2009).</li>
<li>Hutson, M. S., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+cavitation+dynamics+during+pulsed+laser+microsurgery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo.</a> Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).</li>
<li>Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+laser-induced+plasma+formation+in+pulsed+cellular+microsurgery+and+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation.</a> Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).</li>
<li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans.</a> Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).</li>
<li>Tsai, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-mediated+ablation%3A+an+optical+tool+for+submicrometer+surgery+on+neuronal+and+vascular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).</li>
<li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).</li>
<li>Shen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Chem.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).</li>
<li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nanosecond+laser+axotomy%3A+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).</li>
<li>Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+in+vivo+time-lapse+imaging+and+optical+manipulation+of+Caenorhabditis+elegans+in+standard+multiwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates.</a> Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

3,5-11 farklı lazer sistemleri ile lazer mikrocerrahi çeşitli tartışmalar vardır. Femtosecond kızılötesi lazerler, 12 ve rahat bir görüntüleme tesisi ile ilişkili hücre içi lazer ablasyon için &quot;altın standart&quot;, ama bireysel kullanıcılar için genellikle çok pahalı . Görüntüleme derinliği nedeniyle görüntüleme örnek için femtosecond kızılötesi lazer ihtiyacınız varsa o zaman muhtemelen bir lazer axotomy için ihtiyacınız olacak. Yüzeyinin 30-50 um içinde hedef aksonlar Şeffaf dokular muhtemelen yüksek na daldırma objektifi aracılığıyla hedeflenen 20 UJ / nabız aralığında, mavi ve yeşil darbe lazerler ile mümkün. Özellikle hedef akson derinliği artar olarak, femtosecond lazer ile karşılaştırıldığında nano ve pico ikinci lazerler daha çok hasar var. C. elegans şeffaf ve tüm aksonlar yüzeyinin 20-30 um içinde. Biz rutin yüzeyinin 5 um içinde motor aksonlar kesti. Ayrıca kolayca balta kestikmanikür yüzeyi yaklaşık 20 um sinir halkası içinde ons. Biz yetişkin bir solucan çapı ile yaklaşık 30-50 um aksonlar kesme sınırı bulundu. Burada açıklanan lazer ablasyon sistemi, şeffaflık ve derinliği hedef akson kriterlere uygun birçok farklı hazırlıklarını iyi iş olasıdır. Yine de, bu biraz şaşırtıcı IR femtosecond lazerler, nano ve pikosaniye 355 nm ve 532 nm lazerler teorik avantajları göz önüne alındığında, C. lazer axotomy için çok iyi bir performans elegans 6,13. Biz nanosaniyelik 440 nm, 532 nm nanosaniyelik ve femtosecond kızılötesi lazerler lazer axotomy yanıt akson rejenerasyonu açısından herhangi bir farklılık görüyoruz. Katı hal 355 nm UV lazerler 532 nm pasif Q-anahtarlı katı hal lazer pompalanır aynı maliyet ile ilgili, ancak bu kısa dalga boyuna verimli geçmesi ya da daha yüksek güçler veya optik gerektirir. Çoğu optik görünür 400 ile iyi bir performans için tasarlanmıştır.700 nm ışık. 355 nm lazerler 6 gibi düşük plazma eşik, küçük spot büyüklüğü, ve ablasyon lazer hedef% 100 verimli bir şekilde doğrudan ve örnek sinyal kaybı olmadan GFP eş zamanlı görüntüleme sağlayacak uzun bir pas dikroik gibi bazı avantajları sunacak. Mavi 440 nm lazerler, görünür ışık lazer ile (standart optikler ve güvenliği ile iyi bir performans) çalışma avantajlarını tutacak. Ne yazık ki, bir DPP-Q-anahtarlı katı hal 440 nm lazer maliyet, şu anda benzer bir güç 355nm veya 532 nm lazer 3 kez maliyetidir. C için yeni bir sistem tasarımı olsaydı elegans, hedef derinlik az olduğu, 1 UV şeffaf lens (355nm az% 50-70 geçirgenliği ile maliyet 40X 1.3na petrol lens için yaklaşık 3000 $) ve 355 nm lazer 5-10 UJ / darbe üreten bir tercih olur -20 kHz. Axon ablasyon plazma oluşumu nedeniyle olduğu düşünülmektedir. Kısa bakliyat, düşük güç ve plazma hacimleri w plazma eşikleri üretecek<html> hasta 6 adet daha küçük olabilir. Amaç, darbe enerjisi en düşük güç ayarlayarak küçük ve kısa ömürlü plazma üretmek için. Büyük uzun ömürlü plazmalar kavitasyon baloncukları üretecektir hücreleri çevreleyen zarar verebilir. Biz genelde, yüksek frekans (yani 2.5kHz) 50-100 hakkında bakliyat kullanarak o ablasyon bulduk en iyi sonucu verir. Bu hasar yavaş yavaş bakliyat hasarın boyutunu daha iyi kontrol etmek için bir dizi üzerinden entegre edilebilir göstermektedir. Demeti hizalı ve doğru genişletilmiş ise, burada açıklanan lazer ablasyon sistemi, çok bağışlayıcıdır. Biz,% 10 lazer gücü (ortalama 0.3 mW 2500 Hz&#39;de ölçülür ve tahmini 1 UJ / pulse) yetişkin solucan aksonlar kesme ve% 14 güç ile sınırlı lokalize hasar kesebilir. Hasar daha büyük alanlar% 15-39 lazer güç izleyebilirsiniz, ancak sadece% 40 güç (yaklaşık 1 mW ortalama 2500 Hz&#39;de ölçülen) Yukarıdaki solucanlar büyük kavitasyon baloncukları ve solucan manikür zarar nedeniyle patlayabilir. e_content &quot;&gt; Steinmeyer ve ark. 2010 2 kağıt, lazer ablasyon sistemi oluşturmak için mükemmel bir kaynak. Leon Avery de ucuz bir N2 gaz 337 nm lazer tabanlı bir lazer ablasyon sistemi güzel bir pratik tanımı ve bazı büyük pratik sağlar tavsiye (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /) kendi sistemi tasarlarken ilk mikroskop hedefi nasıl ablasyon lazer hedef belirlemek için mikroskop temsilcisi ile konuşmak gerekir. mikroskop bir titreşim izolasyonu masaya monte edilmelidir (Newport, TMI, Thor). breadboard en optimal düzeyde, ancak sağlam bir çelik üst hala manyetik konumlandırıcılı kullanılabilir tüm optik elemanlar yer bırakılmalıdır çünkü dik bir kapsamda özel bir ara modül güzel Ancak, daha az pahalı ve kamera bağlantı noktası (ters) veya epi-floresan bir bağlantı noktasına bağlı bir &quot;birleştirici&quot; kullanmak daha uygun olabilir (bir arka diyafram ve geçirgenliği boyutunu bilmek gerekir<html> blation lazer dalga boyu) objektif lens kullanmak niyetinde. Bir kez bir lazer (örneğin, Crylas, teem, Kristal, ya da CRC) Thor ya da Newport doğru optik elemanlar seçerek, donanım ve güvenlik donanımları ile ilgili yardım için başvurmalısınız karar verir. Biz yer kazanmak için bir çift Galile ışın genişletici karar verdi, ancak basit bir Kepler genişletici bir seçenek (f2/f1 = genişleme faktörü). Özel bir ışın genişletici en pahalı olacak, ama Newport, Thor, ve çeşitli lazer üreticileri mükemmel kalitede ticari ışın genişleticiler sunmaktadır. Bazı lazer üreticileri de uygun maliyetli ve yerden tasarruf edilebilir, manuel ve elektronik kontrollü zayıflatıcılar sunuyoruz, ancak Glan-Thompson polarize ve yarım dalga plakası gibi çok yönlü değil. Ayrıca lazer nasıl kontrol etmek için karar vermeniz gerekir. Lazer şirket tarafından sağlanan ticari bir TTL jeneratör, ya da yazılım kullanmak, bir LabView tabanlı denetleyici tasarımı. Özel lazer üreticisi ile seçenekleri tartışın. çadır &quot;&gt; Biz biz genel bir kılavuz olarak sadece kullanılan var donanımın listesini sağlanan var. Bu sistem bizim mevcut görüntüleme sistemi eklendi zaman hakkında ABD doları 15.000 maliyet burada anlatılan. Sizin yerel Fizik bölümü çoğu zaman için bir pratik giriş sağlamak için istekli birine sahip olacak serbest ışını lazerler ile güvenli bir şekilde çalışıyor. Immobilizasyon ve zaman atlamalı görüntüleme C için alternatif yöntemler elegans son zamanlarda tarif edilmiştir. 14 Sorun Giderme En zor ve kritik bir adım mikroskop optik eksen merkezli genişletilmiş ışın uyum. Bir kere ışın merkezi nihai uyum için direksiyon aynalar kullanarak ÖNCE 5 um mikroskop optik eksen içinde hizalanır almak için çok çalışması gerektiğini Galile lensler ile merkezli ve genişletilmiş var. Mikroskop ışını hizalamak için direksiyon aynalar aşırı kullanımı, ışın ile eksen hareket edecekgenişletici. EXTREME DİKKAT KULLANARAK uygun ND filtre ile lazer ışını zayıflatır ve doğrudan bir yansıtıcı hedef (ön yüzeyi ayna) lazer ışın profili görebilirsiniz. (Demiryolu yüksekliğini ayarlamak için yukarı / aşağı aralığı merkezli edilememesi halinde) tam merkezinde 60X objektif alanında kiriş mikroskop hafifçe dürtmek yapabilirsiniz. Işın profili tam ortalanmış bir dairesel kiriş ve simetrik &quot;işaret fişekleri&quot; vermek için mikroskop optik eksene hizalamak için kullanılabilir. Asimetrik bir parlama mikroskop ekseni mükemmel uyumlu değildir (ya da raylı düz değil) olduğunu bir göstergesidir. Son olarak, L3 ayarlamak ve kiriş ve hatta simetrik bir genişleme ve daralma görmek gerekir. Sonra lazer ışını küçük bir noktaya odaklanmak için L3 ayarlamak Odak mikroskop ve hedef yüzeyinde tam. Artık lazer ışını LSCM veya CCD sistemi üzerinden görüntülü ve ablasyon nokta içinde 5 um merkezinin içinde olduğunu bulmak gerekirZ odak 1um. Eğer solucanlar &quot;havaya uçurmak&quot; ya da sürekli sorun büyük olasılıkla ablasyon lazer ince ayara aksonlar kesmek için büyük kavitasyon baloncukları üreten. En az (&lt;500nm) ablasyon yerinde Z odaklama (L3 lens ile yakınsama ayarlamak) ve XY güvene dayalı spot (son kinematik monte ayna ile ayarlamak) lokalize emin olun. Yüzeye yakın aksonlar Hedefleme daha az lazer güç gerektiren. Benzer şekilde, küçük hayvanlar (L1 ve L2) yetişkinler de aynı aksonlar hedeflemesine göre axotomy için daha az lazer güç gerektirir. Vahşi tip aksonlar rejenere veya aksonları çamaşır suyu yoksa, görüntüleme lazer gücünü azaltarak veya örnekleme oranı azalan denemelisiniz. Solucanları ölmek ya da kalırsanız sickly 1% adımlarla yüzde Agaroz azaltmayı deneyin. Başına yüksek kullanırken bu genellikle onları ölüme neden olacak gibi montaj solucanlar sonra lamel hareket etmiyor emin olun.Burada belirtilmesi gereken agaroz ve mikroküreler. Solucanlar time-lapse oturumu sırasında patlaması ya da ölürseniz nedeniyle: 1. Yüzde agaroz çok yüksek. 2. Hasar ablasyon lazer tarafından kütikülü. 3. Monte edildikten sonra lamel Hareketi. Manikür zarar hata ise sadece ablasyon lazer hedef olmuştur monte solucanlar etkileyecektir. Solucan time-lapse oturumu sırasında çok fazla hareket ederse,% 0.5 &#39;lik adımlarla yüzde agaroz artırmayı deneyin. Sağlıklı solucanlar Sağlıklı aksonlar her zaman &quot;aktif&quot; ve floresans tutarlı bir seviye göstergesi. , Floresan ya da aktivite ani bir düşüş görürseniz solucan ölüyor ya da öldü. Çoklu boncuklu veya parçalanmış aksonlar, ölüyor ya da ölü bir solucanın bir işaretidir. Tüm zaman atlamalı oturumu sırasında odak aksonlar tutmak sorun varsa birkaç farklı sorunları olabilir. İlk 10 saat boyunca bir bardak slayt görüntüleme inert bir örnek sahne sürüklenme kontrolrs. Birkaç mikron sürüklenme termal istikrarsızlık nedeniyle olabilir, ancak muhtemelen 5&#39;inden um mikroskop ile mekanik sorunları nedeniyle. Montaj ile ilgili sorunlar daha sık görülür. Zaman atlamalı başlamadan önce monte solucanlar 30 dakika için mikroskop aşaması ile muvazene edelim. Vazelin mühür zaman atlamalı oturumu sırasında sızıntıları geliştirmek olmadığını kontrol edin.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifi Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> 535 nm Lazer </td><td> Crylas </td><td> FDSS532Q3 </td><td> (Teem, Kristal ve CRC de karşılaştırılabilir lazerlere) </td></tr><tr><td> Tüm optik ve donanım </td><td></td><td></td><td> (Thor karşılaştırılabilir optik ve donanım sunuyor) </td></tr><tr><td> Suprema Optik Mount, çapı 1.0 </td><td> Newport </td><td> SS100-F2KN </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 1 &quot;çap mesaj 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;çap yazılan çatal </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Sıfır Sipariş Akromatik Wavel Tabak, yarım dalga Retardasyon, 400-700nm </td><td> Newport </td><td> 10RP52-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rotasyon Sahne, 1 &quot;Diyafram </td><td> Newport </td><td> RSP-1T </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;çap mesaj 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;çap yazılan çatal </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Glan-Lazer Kalsit Polarize, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> 10GL08AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Polarize Rotasyon Dağı </td><td> Newport </td><td> RM25A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Çapı yazılan ¼ 1 &quot;ayırıcı&quot; </td><td> Newport </td><td> PS-0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ½ &quot;height, 1&quot; çap Mesaj </td><td> Newport </td><td> PS-0.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Çatal, 1 &quot;çap Mesaj </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Işın Dökümü </td><td> Newport </td><td> PL15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Mikroskop Amaç Lens Bayoneti </td><td> Newport </td><td> LH-OBJ1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;çap mesaj 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;çap yazılan çatal </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Yüksek Enerji Nd: YAG Lazer Ayna, 25,4 mm çap, 45 °, 532 nm </td><td> Newport </td><td> 10Q20HE.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Suprema Optik Mount, 1,0 inç çap, temizleme montaj deliği </td><td> Newport </td><td> SN100C-F </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Yüksek Hassas Knob Ayar Vidası, 12.7mm seyahat, 100TPI </td><td> Newport </td><td> AJS100-0.5K </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Konu adaptörü, ¼ -20 erkek, 8-32 kadın </td><td> Newport </td><td> SS-1-B </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 1,5 inç çaplı çubuk için Rod Kelepçe </td><td> Newport </td><td> 340-RC </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Çubuk, uzun boylu 14 inç (35,5 cm) </td><td> Newport </td><td> 40 </td&gt; <td> 1 </td></tr><tr><td> Raylı taşıyıcı X26, kare 40mm uzunlukta </td><td> Newport </td><td> CN26-40 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Çelik Ray, 384mm (15 &quot;) uzunluk </td><td> Newport </td><td> X26-384 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1,5 inç çaplı çubuk Çubuk Platformu </td><td> Newport </td><td> 300-P </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Çubuk, uzun boylu 14 inç (35,5 cm) </td><td> Newport </td><td> 40 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-Konkav Lens, 12.7 mm çap, 25mm EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPC025AR.14 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-Konveks Lens, 25,4 mm çap, 50.2mm EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX082AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Plano-Konveks Lens, 25,4 mm çap, 62.9mm EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX085AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Sabit Lens Mount, 0.5 &quot;çapında, 1.0&quot; Eksen yüksekliği </td><td> Newport </td><td> LH-0.5 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Lens Mount, 1.0 &quot;çapında, 1.0&quot; Eksen yüksekliği </td><td> Newport </td><td> LH-1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Mikroküreler 0.1um </td><td> Polysciences </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> RPI </td><td> A20090 </td><td> EEO konularda </td></tr><tr><td> Muscimol </td><td> Sigma </td><td> M1523 </td><td></td></tr></tbody></table>

axon rejenerasyon eğitim düşük bütçeli lazer axotomy sistemi oluşturulması c. elegans</em

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Time-lapse mikroskobu ile takip Lazer axotomy C ile akson rejenerasyonu fenotipleri için hassas bir testtir elegans 1. Bu testte temel zorluk, bir lazer ablasyon sistemi 2,3 uygulanması için gerekli olan algılanan maliyet ($ 25-100K) ve teknik uzmanlık. Ancak, mütevazı maliyetleri (&lt;$ 10K) solid-state darbe lazerler lazer ablasyon hedef aksonlar doku yüzeyine &quot;yakın&quot; şeffaf hazırlıkları için sağlam bir performans sağlayabilir. İnşaat ve hizalama bir sistem, bir gün içinde yapılabilir. Odaklanmış kondenser ablasyon lazer ışığı tarafından sağlanan optik yol, uygun bir uyum kılavuzu sağlar. Kaldırılır tüm optik ile bir ara modül ablasyon lazer adanmış ve lazer ablasyon oturumu sırasında herhangi bir optik elemanlar hareket gerekirse sağlar. Ara modül dikroik, eş zamanlı görüntüleme ve lazer ablasyon sağlar. Lazer ışını t Merkezlemeo odaklı mikroskop yoğunlaştırıcı lens ışın sistemi ilk uyum yönlendirir. Lensler çeşitli durum ve seçilen objektif lens arka diyafram doldurmak için kullanılan lazer ışını genişletmek. Final ön yüzeyi aynalı cam slayt hedefi ile uyum ve test yapılır. Lazer gücü minimum boyut ablasyon spot (&lt;1um) vermek için ayarlanır. Ablasyon nokta son kinematik monte ayna görüntüleme penceresinde sabit çapraz kıllar ince ayar ile ortalanır. Lazer güç axotomy için minimum hedef slayt (Bu kullandığınız hedef değişebilir) ablasyon nokta için gerekli olandan daha yüksek yaklaşık 10X olacaktır. Worms agaroz pedleri (veya mikroakışkan odaları 4) montaj, lazer axotomy ve time-lapse görüntüleme için immobilize olabilir . Agaroz pedleri mikrodalga erimiş dengeli tuz çözeltisi içinde% 10 agaroz ile kolayca yapılır. Bir damla erimiş agaroz cam bir slayt üzerine yerleştirilen ve başka bir ile düzleştirilmişbir yastık içine cam slayt kalınlığında yaklaşık 200 um (komşu slaytlar zaman bant, tek katmanlı bir boşluk bırakan olarak kullanılır). &quot;Sharpie&quot; kap, 13mm üniformalı bir çaplı dairesel bir ped kesmek için kullanılır. Anestezik (1ul Muscimol 20mm) ve Mikroküreler (Chris Fang-Yen kişisel iletişim) (1ul 2.65% Polistiren 0,1 um su), sol tarafta yatan böylece odaklı 3-5 solucanlar tarafından takip pad merkezine eklenir. Bir cam lamel uygulanır ve daha sonra vazelin lamel mühür ve örnek buharlaşmasını önlemek için kullanılır.

Lazer axotomy time-lapse görüntüleme mutasyonların etkileri de tahlil için hassas bir şekilde<em&gt; C. elegans</em&gt; Akson rejenerasyonu. Yüksek kaliteli, ama ucuz, lazer ablasyon sistemi en mikroskoplar kolayca eklenebilir. Time lapse görüntüleme 15 saat boyunca, solucan dikkatli immobilizasyon gerektirir.

Axon Rejenerasyon Eğitim Düşük bütçeli Lazer Axotomy Sistemi oluşturulması C. elegans</em

Time-lapse mikroskopi ile takip edilen lazer aksonotomisi, C. elegans'taki akson rejenerasyon fenotipleri için hassas bir analiz yöntemidir1. Bu analiz yönteminin temel zorluğu...

Bu prosedürün genel amacı, CL gangliyonlarında akson rejenerasyonunu incelemek için bir lazer ablasyon sisteminin nasıl kurulacağını ve hizalanacağını göstermektir. Bu işlem; öncelikle bir lazer bezi Thompson polarizörü, yarım dalga plakası, yönlendirme aynası, periskop rayı ve ray aynasının bir optik masaya monte edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, lazer ışınının mikroskop kondansatör lensinden çıkan ışınla hizalanmasıdır.Ardından, lazer ışınını merkezlemek ve sıfır ıraksama sağlamak için lazer ışını genişletici lens monte edilir, hizalanır ve konumlandırılır. Prosedürün son adımı, hassas ayarlamalar yaparak lazer ablasyon noktasını görüntü odağıyla çakışır hale getirmektir. Nihayetinde, kusurlu XY NC hizalaması durumunda bile, difraksiyon limitli lazer ışını kullanılarak kollateral doku hasarı minimum düzeyde tutularak yarım mikronluk aksonların hassas bir şekilde kesilmesi mümkündür.Bu tekniğin Femtosaniye lazerler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, 15.000 ile nispeten ucuz olmasıdır. Bakım gereksinimi oldukça düşüktür ve çok hassas akson kesimi sağlar. Bu yöntem, C. elegans akson rejenerasyonu hakkında bilgi sağlayabildiği gibi; sinekler, zebra balığı, fare, periferik sinir sistemi ve in vitro hücreler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.Temelde yüzeyin 30 ila 50 mikrometre yakınındaki her hücre. Bileşenler breadboard üzerine yerleştirilmiş haldeyken işe başlayın; lazer periskop direğini ve yükseltilmiş ray desteklerini cıvatalarla sabitleyin. Bu sistem, gözlerinize kolayca zarar verebilecek Sınıf 3B bir lazer kullanmaktadır, bu nedenle lütfen lazer güvenliği kurallarını ciddiye alın.Serbest ışınlı lazerlerle güvenli çalışma yöntemleri hakkında yerel fizik bölümünüzden birine danışın. Hizalama işlemi boyunca lazeri her zaman en düşük güçte tutun. Okülerlerden bakarken, lazerin mekanik olarak kapatıldığından ve lazerin kapalı olduğundan emin olun.Şimdi, mikroskobu öncelikle konumlandırın ve ray ekseniyle hizalayın. İkinci olarak, mikroskop kondansatör lensinden gelen iletim ışık demetiyle hizalayın. Üçüncü olarak, raya sabitlenmiş ayarlanabilir bir diyafram veya lens kullanarak rayın her iki ucunu kondansatör demetiyle hizalayın.İşleme devam etmeden önce ray yüksekliğini ayarlamak için bir terazi ve laboratuvar krikoları kullanın. Rayın her iki ucunun da hizalı olduğundan emin olun. Şimdi, lazer ışınının gland, Thompson polarizörü ve yarım dalga plakası üzerinden geçtiğinden ve döndürme sırasında bunların kenarlarına çarpmadığından emin olun.Yarı geçirgen plaka, tüm bileşenler ekmek tahtasına sabitlenmiş haldeyken lazerin gücünü ayarlayacaktır. Lazeri açın, darbe frekansını 100 sürekli moduna ayarlayın ve yarı geçirgen plakayı kullanarak gücü minimuma indirin. Lazer ışınını görselleştirmek için bir yapışkanlı not kağıdı veya lens kağıdı kullanın.Şimdi lazer ışınını ekmek tahtasından (breadboard) yukarı çıkaralım. Işını, yükseltilmiş rayın ucuna monte edilmiş aynaya ulaştırmak için lazerden başlayarak kinematik montajlı aynaları sırasıyla ayarlayın ve sabitleyin. İşlem tamamlandığında, lazer ışını aynaların yaklaşık olarak merkezine hizalanmış olmalı ve lazer ışını mikroskobun iletilen ışık ışını ile hizalanmadan önce aynalar, lazer ışını eksenine yaklaşık 45 derece açıyla yönlendirilmiş olmalıdır.Ara modüldeki tüm ND filtrelerini ve diyaframları kaldırın veya açın. Şimdi, aşırı yan hasar vermeden aksonların hassas bir şekilde kesilmesini sağlamak için en kritik adıma başlıyoruz. En küçük ablasyon noktasını elde etmek için lazeri, en düşük lazer gücünde x, y ve Z eksenlerinde hassas bir şekilde hizalayacağız.Lazer ve iletilen ışık demetleri, bir kağıt üzerinde eş zamanlı olarak görülebilir. Başlamak için kağıdı mikroskop portunun yakınına yerleştirin. Şimdi periskobun üzerindeki aynada ve rayın ucundaki aynada bulunan kaba ayarları kullanarak lazeri hizalamaya başlayın.Hizalanmış kondansatör merceği ile açık objektif taretinin arasına bir kâğıt yerleştirin. Lazer ışınını, daha geniş olan iletilen ışık ışınının merkezine hizalamak için ray aynasındaki hassas ayarları kullanmaya devam edin. Şimdi, mikroskobu klemplerle yerine sabitleyin.Lazer hizalamasının değerlendirilmesine ilişkin ek adımlar yazılı makalede bulunabilir. 300 mikronluk lazer ışınını, 10 milimetrelik objektifin arka açıklığını dolduracak şekilde 33 kat genişletmek için çift galilean ışın genişleticiler kurulmalıdır. İşleme, dört lensi taşıyıcılara monte ederek başlayın.Ardından, tüm lensler aynı optik eksende ve lazer ışınına tam dik olacak şekilde ray üzerine sabitleyin. Lazeri açın ve minimum güç ile sürekli moda ayarlayın. Her bir lensteki ışın hizalamasını yaklaşık olarak ayarlayın.Işını görmek için kağıt kullanın. Şimdi lazeri kapatın. Lazere bir güvenlik kapağı takın ve mikroskobu lazer ışınının yolundan kaldırın.Lazeri tekrar açın ve yakın bir duvardaki görüntüsünü inceleyin. Işını genişletmek için lenslerin ince ayarını kullanın. Ardından, ışını objektif arka açıklığının tahmini konumunda tekdüze parlaklıkta bir daire şeklinde hizalamak için kinematik montajlı son iki aynayı ayarlayın.Işının boyutunu ve düzenliliğini kağıt üzerinde gözlemleyin. Ardından, kağıt lensten uzaklaştırıldıkça ışın boyutunun nasıl değiştiğini takip ederek ışını sıfır yakınsamaya ayarlayın. Lazeri kapatın ve mekanik kepengi kapatın.Doğru hizalamayı belirlemek için sabit klempleri kullanarak mikroskobu tekrar lazer ışını yoluna sürün. Klempleri mikroskobun boş olan tarafına yerleştirin ancak onları tamamen sıkmayın. Şimdi lazeri açın.Güvenlik panjurunu kaldırın ve objektif taretini açık konuma getirin; sahne üzerinde bir kâğıt kullanarak, kondansatörden gelen iletilen ışık demetinin merkezinde, genişletilmiş ve tekdüze lazer demeti görünür olmalıdır. Eğer merkezlenmemişse, mikroskop kelepçelerini gevşeterek ve mikroskobu dikkatlice hareket ettirerek demetleri merkezleyin. Şimdi güvenlik panjurunu kapatın ve lazeri tetikleme moduna ayarlayın.60x objektifi olduğu yerde döndürün. Şimdi hedef lam üzerindeki yüzey çiziklerini görüntüleyin. Güvenlik kepenklerini kaldırın, ablasyon lazerini tetikleyin ve lazer gücünü minimum ablasyon noktası için ayarlayın.Leke dairesel olmalı ve görüntü merkezinin 5 ila 10 mikronu içinde, yani ablasyon lekesinin merkezinde bulunmalıdır. Lekenin merkezde kalmasını ve ışın profilinin homojen olmasını sağlamak için kinematik montajlı ray aynasının hassas ayarları kullanılarak, ray montajlı aynanın ve üst periskop aynasının iteratif olarak ayarlanması gerekecektir. Odak noktasını bir mikronluk adımlarla sistematik olarak yukarı ve aşağı hareket ettirerek ve her adımda ablasyon lazerini tetikleyerek lazerin Z odağını değerlendirin.Işın doğru şekilde genişletilmiş, hizalanmış ve konverjans ayarları doğru yapılmışsa, görüntü odağında maksimum ablasyon yapmalı; odağın bir mikron üzerinde veya altında ise zayıf ablasyon yapmalı veya hiç yapmamalıdır. Maksimum ablasyon noktası görüntü odağının üzerinde veya altındaysa, lazer ablasyonu görüntü odağıyla örtüşene kadar Galilean teleskobun L3 merceğini hareket ettirerek genişletilmiş ışının Z odağında son ayarlamaları yapın. Nematodlar özelleştirilmiş bir lam üzerine monte edilmiş ve aksonlar kurulan sistem kullanılarak ablate edilmiştir; Lazer eksosomisi ve akson rejenerasyonunun time-lapse görüntülemesi oldukça başarılı olmuştur.Motorize bir tabla kullanılarak, tek bir lam üzerinde beş farklı hayvandan beş aksonun rutin ve hassas bir şekilde kesilmesi ve görüntülenmesi mümkün olmuştur. Aksonların görüntüleme süresi sınırlayıcı faktördü.Deneylerin yaklaşık %10'u yüksek kaliteli time-lapse videolar üretmiştir. Geriye kalan deneylerin tamamı iyi veriler sağlamış, ancak genellikle beş ila sekiz saatlik immobilizasyondan sonra başlayan küçük titreme hareketleri nedeniyle estetik açıdan daha az etkileyici olmuştur. Bu prosedür uygulanırken, lazerin x, y ve Z eksenindeki hizalamasını doğru bir şekilde değerlendirmek her zaman önemlidir.İnsanların akson kesmeye çalışırken karşılaştıkları en yaygın sorun, kollateral hasardır veya aksonların tamamen kesilememesidir ve bu durum neredeyse her zaman yanlış hizalanmış bir lazerden kaynaklanır. Bu lazer ablasyon sistemi ve c Agains'te akson rejenerasyonunu görselleştirme tekniği, herhangi bir genetik mutasyonun akson rejenerasyonu üzerindeki etkisini rutin olarak analiz etmenize olanak sağlayacaktır. NCL Agains.

constructing-low-budget-laser-axotomy-system-to-study-axon

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada, uzun vadeli görüntüleme, iki foton görüntüleme ve doku hasarı teknikleri ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme zebrafish embriyolar montaj için bir yöntem açıklanmaktadır.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

C in vivo Lazer Axotomy elegans

Bu videoda, bir Drosophila melanogaster larvasındaki aksonların iki fotonlu lazer ablasyonu ve yaralanmayı indüklemek ve yaralanma bölgesini görüntülemek için örnek bir protokol açıklanmaktadır.

İki Foton Lazer Kaynaklı Nöral Yaralanma: Drosophila Larvalarında Akson Dejenerasyonu ve Rejenerasyonunu Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Bu video, solucan epidermisinde çok hassas yaralanmalara neden olmak için kullanılan bir lazer yaralama yöntemini tanıtmaktadır. Örnek protokol, yara tepkisi ve onarımı üzerine yapılan bir çalışmadan alınmıştır.

Epidermal Lazer Yarası: C. elegans'ta Onarım Süreçlerini İncelemek İçin Lokalize Hasara İndükleme

Bu video, iki foton lazer aksotomi kullanarak ve yaralanmadan aksonal iyileşmeyi gözlemleyerek zebra balığı embriyolarında aksonları yaralama yöntemini açıklamaktadır.

İki Fotonlu Lazer Aksotomi: Zebra Balığı Embriyolarında Aksonları Yaralamak ve Aksonal İyileşmeyi Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Bu video, yüksek güçlü bir lazer kullanarak Drosophila larvalarında hedeflenen nöronal hasarı indüklemek için bir yöntemi göstermektedir. Larvaları mikroskop altında konumlandırdıktan sonra, düşük güçlü bir lazer floresan nöronları tarar ve daha sonra lokalize hasarı indüklemek için lazer gücü artırılır. Yaralanma, artan floresan ve yaralanma bölgesinde bir krater ile doğrulanır.

Bir Drosophila larvasında yüksek güçlü bir lazer kullanarak hedeflenen nöronal hasarın indüklenmesi

Lazer nanodissection bağlanmış iki foton görüntüleme, hücre içi çözünürlük ile merkezi sinir sisteminin dejeneratif ve rejeneratif işlemlerini incelemek için yararlı araçlardır. Bu protokol, etiket görüntü ve in vivo serebellar korteks bir tırmanma lifleri incelemek için gösterilmiştir.

Serebellar Aksonlar Lazer Nanosurgery<em&gt; In Vivo</em

Yetişkin C. elegans derisi, yara kapanması, yara oluşumu ve doğuştan gelen bağışıklık dahil olmak üzere epitelyal yara tepkileri çalışmaları için izlenebilir bir modeldir.

Içinde Yara Yanıtları Cilt yaralayarak Yöntemleri ve Testler ° C. elegans

Burada, duyusal nöron - vivo içinde birleştirir dendritik arborization (da) nöron yaralanma modeli, canlı görüntüleme Drosophila , İki fotonlu lazer axotomy/dendriotomy ve güçlü sinek genetik araç, olarak bir iletişim kuralı'nı mevcut olası rehberleri ve neuroregeneration inhibitörleri süzmek için bir platform.

Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir Vivo Drosophila yaralanma modeli

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Bu protokol, larva elleçlemesi için otomatik bir mikroakışkan platform ile birleştirilmiş bir lazer lezyon sistemi kullanarak zebra balığı larvalarında dokuya özgü ve yüksek oranda tekrarlanabilir yaralanmaları indüklemek için bir yöntemi açıklamaktadır.

Zebra Balığı Larvalarında Omurilik Rejenerasyonunu İncelemek için Kontrollü Yarı Otomatik Lazer Kaynaklı Yaralanmalar

Öğrenin C. elegans'ta akson rejenerasyonunu incelemek için düşük maliyetli lazer aksotomi sisteminin montajını ve hizalanmasını. Bu yöntem, minimal hasarla hassas kesim sağlayarak sinirbilim araştırmalarında değerli bir araçtır.

Axon Rejenerasyon Eğitim Düşük bütçeli Lazer Axotomy Sistemi oluşturulması C. elegans

Daha fazla video keşfet