Axon Rejenerasyon Eğitim Düşük bütçeli Lazer Axotomy Sistemi oluşturulması C. elegans

Bu prosedürün genel amacı, CL ganlarda akson rejenerasyonunu incelemek için bir lazer ablasyon sisteminin nasıl monte edileceğini ve hizalanacağını göstermektir. Bu, önce bir lazer bezi Thompson polarizör, yarım dalga plakası, döndürme aynası, periskop rayı ve ray aynasının bir devre tahtasına monte edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, lazer ışınını mikroskop kondansatör merceğinden giden ışına hizalamaktır.

Daha sonra lazer ışını genişletici lens, lazer ışınını merkezlemek ve sıfır sapma yapmak için monte edilir, hizalanır ve konumlandırılır. İşlemin son adımı, ince ayarlamalar yaparak lazer ablasyon noktasını görüntü odağı ile uyumlu hale getirmektir. Sonuç olarak, kusurlu XY NC hizalaması olduğunda, kırınım sınırlı lazer ışını kullanarak minimum kollateral doku hasarı ile yarım mikron aksonları hassas bir şekilde kesmek mümkündür.

Bu tekniğin Femto saniye lazerleri gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, 15.000'de nispeten ucuz olmasıdır. Nispeten bakım gerektirmez ve çok hassas akson kesimi sağlar. Bu yöntem deniz elgan akson rejenerasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, sinekler, zebra balığı faresi, periferik sinir sistemi ve in vitro hücreler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Temel olarak, yüzeyin 30 ila 50 mikrometre yakınında bulunan herhangi bir hücre. Breadboard üzerine yerleştirilmiş bileşenlerle başlayın ve lazer periskop direğini ve yükseltilmiş ray desteklerini cıvatalayın. Bu sistem, gözlerinize kolayca zarar verebilecek üç Sınıf B lazer kullanır, bu nedenle lütfen lazer güvenli güvenliği ciddiye alın.

Serbest ışın lazerleriyle güvenli bir şekilde nasıl çalışılacağı konusunda yerel fizik departmanınızdaki biriyle konuşun. Hizalama işlemi sırasında her zaman lazeri en düşük güce ayarlayın. Oküler kısımdan baktığınızda, lazerin mekanik olarak kapatıldığından ve lazerin kapalı olduğundan emin olun.

Şimdi, mikroskobu önce konumlandırın, ray ekseni ile hizalayın. İkinci olarak, mikroskop kondansatör merceğinden iletilen ışık huzmesi ile hizalayın. Üçüncüsü, raya takılmış ayarlanabilir bir açıklık veya lens kullanarak rayın her iki ucunu da kondansatör ışınına hizalayın.

Devam etmeden önce ray yüksekliğini ayarlamak için bir seviye ve laboratuvar krikoları kullanın. Rayın her iki ucunun da hizalandığından emin olun. Şimdi, lazer ışınının bezden, Thompson polarizörden ve yarı plakadan geçtiğinden ve dönerken kenarlarına çarpmadığından emin olun.

Yarım plaka, tüm bileşenler devre tahtasına sabitlenmiş olarak lazerin gücünü ayarlayacaktır. Lazeri açın, darbe frekansını 100 sürekli moda ayarlayın ve yarım plakayı kullanarak gücü minimuma indirin. Lazer ışınını görselleştirmek için bir post-it notu veya lens kağıdı kullanın.

Şimdi lazer ışınını devre tahtasından yukarı çıkarmak için. Işını yükseltilmiş rayın ucuna monte edilmiş aynaya getirmek için kinematik olarak monte edilmiş aynaları lazerden sırayla ayarlayın ve sabitleyin. Bittiğinde, lazer ışını kabaca aynaların merkezine hizalanmalı ve lazer ışınını mikroskobun iletilen ışık huzmesi ile hizalamadan önce aynalar lazer ışını eksenine kabaca 45 derece yönlendirilmelidir.

Ara modüldeki tüm ND filtrelerini ve açıklıklarını çıkarın veya açın. Şimdi, aşırı ikincil hasar olmadan aksonların hassas bir şekilde kesilmesini sağlamak için en kritik adıma başlıyoruz. En küçük ablasyon noktasını vermek için lazeri en düşük lazer gücünde x, y ve Z ekseninde hassas bir şekilde hizalayacağız.

Lazer ve iletilen ışık huzmeleri kağıda karşı aynı anda görülebilir. Başlamak için kağıdı mikroskop bağlantı noktasının yakınına yerleştirin. Şimdi periskopun üstündeki ayna ve rayın ucundaki ayna üzerindeki rota ayarlamalarını kullanarak lazeri hizalamaya başlayın.

Hizalanmış kondansatör merceği ile açık objektif tareti arasına bir kağıt yerleştirin. Lazer ışınını iletilen daha büyük ışık huzmesinin merkezine hizalamak için ray aynasındaki ince ayarları kullanmaya devam edin. Şimdi, mikroskobu kelepçelerle yerine sabitleyin.

Lazerin hizalanmasını değerlendirmeye ilişkin ek adımlar yazılı makalede bulunabilir. 300 milimetrelik objektifin arka açıklığını doldurmak için 33 mikron lazer ışınını 10 kat genişletmek için çift celile ışını genişleticileri kurulmalıdır. Dört lensi taşıyıcılara monte ederek başlayın.

Ardından lensleri, hepsi aynı optik eksende ve lazer ışınına tam olarak dik olacak şekilde raya takın. Lazeri açın ve minimum güce ve sürekli moda ayarlayın. Her bir lens boyunca ışın hizalamasını kabaca ayarlayın.

Işını görmek için kağıt kullanın. Şimdi lazeri kapatın. Lazere bir güvenlik kapağı uygulayın ve mikroskobu lazer ışınının yolundan çıkarın.

Lazeri tekrar açın ve yakındaki bir duvara karşı görselleştirin. Işını genişletmek için lenslerin ince ayarını kullanın. Ardından, ışını objektif arka açıklığının tahmini konumunda eşit parlaklıkta bir daireye hizalamak için kinematik olarak monte edilmiş son iki aynayı ayarlayın.

Işının kağıda karşı boyutunu ve tekdüzeliğini görüntüleyin. Ardından, kağıt mercekten uzaklaştıkça ışın boyutunun nasıl değiştiğine dikkat ederek ışını sıfır yakınsamaya ayarlayın. Lazeri kapatın ve mekanik deklanşörü devreye sokun.

Doğru hizalamayı tanımlamak için sabit kelepçeleri kullanarak mikroskobu lazer ışını yoluna geri kaydırın. Mikroskobun serbest tarafındaki kelepçeleri yerine takın, ancak sıkmayın. Şimdi lazeri açın.

Güvenlik panjurunu çıkarın ve sahne üzerinde kağıt kullanarak objektif taretini açık bir konuma döndürün ve kondansatörden iletilen ışık huzmesi üzerinde ortalanmış genişletilmiş ve düzgün lazer ışını görünür olmalıdır. Merkezlenmemişse, mikroskop kelepçelerini gevşeterek ve mikroskobu dikkatlice iterek kirişleri ortalayın. Şimdi güvenlik kapağını devreye sokun ve lazeri tetikleme moduna ayarlayın.

Hedefi yerinde 60 kez döndürün. Şimdi yüzeyin görüntüsü bir hedef slaytta çizikler. Güvenlik kapağını çıkarın, ablasyon lazerini tetikleyin ve lazer gücünü minimum ablasyon noktası için ayarlayın.

Nokta dairesel olmalı ve görüntü merkezinin, merkezinin, ablasyon noktasının beş ila 10 mikronu içinde olmalıdır. Spotu merkezde ve ışın profilini tekdüze tutmak için kinematik olarak monte edilmiş ray aynasının ince ayarlarını kullanarak, raya monte aynayı ve üst periskop aynasını yinelemeli olarak ayarlamak gerekecektir. Odağı bir mikronluk adımlarla sistematik olarak yukarı ve aşağı hareket ettirerek lazerin Z odağını değerlendirin, her adımda ablasyon lazerini tetikleyin.

Işın doğru şekilde genişletilip hizalanmışsa ve doğru ayarlanmış yakınsama ile, görüntü odağında maksimum düzeyde azalmalı ve odağın bir mikron üstünde veya altında zayıf olmalı veya hiç olmamalıdır. Maksimum ablasyon noktası görüntü odağının üstünde veya altındaysa, lazer ablasyonu görüntü odağıyla uyumlu olana kadar Galilean teleskobunun L üç merceğini hareket ettirerek genişletilmiş ışının Z odağında son ayarlamaları yapın. Nematodlar özelleştirilmiş bir slayta monte edildi ve aksonlar yapılandırılmış sistem kullanılarak ablasyon yapıldı: Lazer ekzozozo ve akson rejenerasyonunun hızlandırılmış görüntülemesi çok sağlamdı.

Motorlu bir aşama kullanarak, beş farklı hayvanda beş aksonu rutin ve hassas bir şekilde kesmek ve görüntülemek mümkün oldu. Tek bir slaytta. Aksonlar için görüntüleme süresi sınırlayıcı faktördü.

Deneylerin yaklaşık% 10'u yüksek kaliteli hızlandırılmış filmler üretti. Kalan deneylerin hepsi iyi veriler sağladı, ancak solucanın genellikle beş ila sekiz saatlik hareketsizlikten sonra başlayan küçük titreme hareketleri nedeniyle estetik olarak daha az çekiciydi. Bu prosedürü denerken, lazerin x, y ve Z eksenindeki hizalamasını doğru bir şekilde değerlendirmek her zaman önemlidir.

İnsanların akson kesmeye çalışırken yaşadıkları en yaygın sorun, ikincil hasar veya aksonları kesememedir ve bu neredeyse her zaman yanlış hizalanmış bir lazerden kaynaklanır. Bu lazer ablasyon sistemi ve c Agains'te akson rejenerasyonunu görselleştirme tekniği, herhangi bir genetik mutasyonun Akson rejenerasyonu üzerindeki etkisini rutin olarak test etmenize izin verecektir. NCL'ye karşı.